脂肪酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及脂肪酶及其应用。具体而言，本发明专利技术提供一种多肽，所述多肽选自：(1)在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列第150、222、285和291位中的至少一个位置上具有取代突变的多肽；和(2)由(1)所示的多肽与促进(1)所示多肽表达与纯化的多肽组成的多肽。本发明专利技术还提供编码多肽的多核苷酸序列，含多核苷酸序列的核酸构建物，宿主细胞，以及相关的用途。本发明专利技术的多肽为脂肪酶，可用于油脂精炼、油脂加工、油脂化工、饲料改良剂、食品工业、生物柴油制备和医药工业中。

Lipase and its application

The invention relates to lipase and its application. Specifically, the invention provides a polypeptide selected from: (1) a polypeptide with a substituent mutation at at least one position in the amino acid sequence 150th, 222nd, 285th and 291 bits shown by SEQ ID NO:2, and (2) a polypeptide expressed by (1) and a polypeptide expressed and purified by the promotion (1) of a polypeptide expressed and purified. The invention also provides polynucleotide sequences encoding polypeptides, nucleic acid constructs containing polynucleotide sequences, host cells, and related uses. The polypeptide of the invention is lipase, which can be used in oil refining, oil processing, oil chemical industry, feed improver, food industry, biodiesel preparation and pharmaceutical industry.

【技术实现步骤摘要】
脂肪酶及其应用
本专利技术涉及脂肪酶变体及其应用。
技术介绍
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)，又称三脂酰甘油酰基水解酶(triacylglycerol)，是一种在水相中能水解长链酯类化合物，也能在非水相中催化酯类合成反应或者转酯反应的酶类。脂肪酶在自然界中分布广泛，在微生物，动物及植物中都有脂肪酶被报道，其中以微生物脂肪酶资源最为丰富，因而微生物脂肪酶成为工业脂肪酶的主要来源。脂肪酶的应用很广泛，包括在油脂加工、油品化工、食品工业、医药卫生、化学化工等领域都有广泛的应用。油脂工业中对于高酸值油脂一般需要有脱酸的步骤，常用的碱炼脱酸和物理脱酸方法都存在损耗过高的问题，还会造成油脂中谷维素等营养成分的大量损失，此外还将产生大量的有机废水，污染环境。脂肪酶法脱酸是一种新型油脂脱酸方法。该法利用特定的脂肪酶在一定条件下催化油脂中的游离脂肪酸(FFA)与甘油发生酯化反应，使大部分FFA转化成甘油酯，从而降低米糠油中FFA的含量。生物柴油是以含羧酸基化合物的油脂，例如动植物油脂、酸化油等为原料，通过酯化或酯交换工艺制备的可再生清洁燃料，属于生物质能之一。较传统石化柴油而言，生物柴油具有良好的燃料性能、较高的安全性能和发动机低温启动性能，且润滑性能好，可延长发动机的使用寿命，是一种真正的绿色能源，广受世界各国的高度重视。目前工业上大多使用化学法来生产生物柴油，虽然产率较高，但存在醇消耗量大，产物难回收，环境污染大等缺点，利用脂肪酶的酶法制备生物柴油具有反应条件温和，特异性强，产品易分离、对环境无污染等优势，已成为目前生物柴油制备技术的主流发展方向。制备生物柴油的脂肪酶在催化特性上也存在着差异，南极假丝酵母脂肪酶B(CandidaantarcticalipaseB，CALB)没有位置特异性，可以同时作用于甘油三酯1,2,3位上的酯键。CALB脂肪酶对水溶性和非水溶性物质都表现出较高的催化活性，应用最为广泛。但是，天然的CALB仍然存在一定的缺陷，如热稳定性较差、水含量耐受性较差等。1995年CalB被成功克隆，并在米曲霉(Aspergillusoryzae)中进行了高效表达，并由诺维信公司成功商业化。CalB的应用主要是将CalB酶蛋白吸附/结合到介质上形成固定化酶的形式进行应用，比如生物柴油制备领域。固定化CalB经常由于甲醇、杂质等因素而达不到应有的重复使用次数。因此需要更稳定、反应速度更快或酯化率更高的CalB突变体。通过突变提高CalB的酶活性质的报道有：CN102660517A公开了含D223G、L278M及它们的组合的CALB突变体热稳定性获得提高；KR20120114129公开了突变体V139和/或I255突变为E或D或R或K能够增强CalB的活力。CN102612557A公开了含T40A、T40V或T40S；A281V、A281E、A282L、A282T、A282C、A282P、A282I、A282D、A282V、A282M、A282R和I285F的一个突变或双突变的CalB突变体增加了脂肪酶对所述多元醇的单酰基化的选择性)。CN103881992A公开了对布洛芬类化合物的酯衍生物展现出更高的活性及选择性的突变体。CN104745550A公开了CalB突变体A141S-A283V、CALB-Lost、S201D、A141S、S47N-Q106H、T138S-S47N，可在非水相催化制备(R)-3-取代戊二酸单烷基酯类化合物。从这些公开可以看出，CalB在羧基与羟基的合成中广泛使用，并不仅限于制备脂肪酸甲酯或乙酯。本领域仍然需要酶学性质有进一步提高的CALB脂肪酶突变体。本申请提供的CALB脂肪酶突变体的与野生型CalB脂肪酶相比，酯化比活力提高，对甲酯的水解偏好性降低，而且对甲醇的耐受能力提高，适合于酯化反应、水解反应等方向应用。
技术实现思路
本申请的目的是提供脂肪酶CALB突变体。具体地，所述的CALB脂肪酶突变体的酯化比活力提高，甲酯的水解偏好性降低，而且对甲醇的耐受能力提高，适合于酯化反应、水解反应、酯交换反应等方向应用，特别是生物柴油制备、油脂脱酸精炼等应用。因此，本专利技术第一方面提供一种多肽，所述多肽选自：(1)在SEQIDNO:2所示氨基酸序列第150、222、285和291位中的至少一个位置上具有取代突变的多肽；和(2)由(1)所示的多肽与促进(1)所示多肽表达与纯化的多肽组成的多肽。在一个或多个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：4或6所示。在一个或多个实施方案中，所述多肽为脂肪酶。本专利技术第二方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸选自：(1)编码本专利技术多肽的多核苷酸；(2)与(1)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸；和(3)(1)或(2)所述的多核苷酸的长10-40个碱基，优选15-30个碱基的片段。在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸的序列如SEQIDNO：3或5所示。本专利技术第三方面提供一种多核苷酸构建物，所述多核苷酸构建物含有本专利技术所述的多核苷酸。在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸构建物为表达载体或克隆载体。在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸构建物是表达载体或克隆载体。本专利技术第四方面提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞：(1)表达本专利技术所述多肽；和/或(2)含有本专利技术的多核苷酸或多核苷酸构建物。本专利技术第五方面还提供一种组合物，所述组合物含有本专利技术的多肽和任选的辅料，优选的，所述辅料为缓冲液(液体酶)或为选自树脂、活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等吸附材料(固定化酶)。本专利技术第六方面提供了本申请的多肽、核酸分子、载体、细胞、组合物在油脂精炼、油脂加工、油脂化工、饲料改良剂、食品工业、生物柴油制备和医药工业中的应用。本专利技术第七方面提供生物柴油的制备方法，其特征在于包括使用本专利技术的多肽合成生物柴油的步骤，可以是酯化反应或酯交换反应。在一个或多个实施方案中，以含羧酸基化合物的油脂和含羟基的化合物为原料，在水和本专利技术的多肽的存在下进行酯化反应或酯交换反应的步骤。在一个或多个实施方案中，含羟基化合物是有机醇。在一个或多个实施方案中，有机醇选自甘油、甲醇、乙醇及其一种或多种的混合物。在一个或多个实施方案中，含羧酸基化合物的油脂指酸价超过国家标准的食用油脂；优选地含羧酸基化合物的油脂选自：毛油、部分精炼的油脂、餐饮废油、粗油酸、酸化油、或PFAD与脂肪酸酯的混合物；优选地PFAD和脂肪酸酯的混合物中，以重量计，PFAD的含量为1～80％，脂肪酸酯的含量为20～99％；更优选地，该脂肪酸酯是脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。在一个或多个实施方案中，有机醇以分批或流加的方式添加。在一个或多个实施方案中，有机醇的摩尔用量为所述含羧酸基化合物的油脂中羧酸基团摩尔数的1倍以上。在一个或多个实施方案中，多肽的用量为含羧酸基化合物的油脂重量的0.01％及以上，例如0.01～0.3％之间；在一个或多个实施方案中，任选地，添加水，水的添加量为含羧酸基化合物的油脂重量的1％以上，例如1～30％、2～20％或2～5％之间；在一个或多个实施方案中，添加碱调节反应物的pH，优选地，碱是NaOH，更优选地碱的添加量为含羧酸基化合物的油脂重量的0.005％以上，例如在0.005～0.15％或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽选自：(1)在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列第150、222、285和291位中的至少一个位置上具有取代突变的多肽；和(2)由(1)所示的多肽与促进(1)所示的多肽表达与纯化的多肽组成的多肽；优选地，所述多肽在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列第150和291位具有取代突变；或所述多肽在第222和285位具有取代突变；更优选地，所述多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO：4或6所示的多肽；或所述多肽是如SEQ ID NO：4或6所示的氨基酸序列与选自信号肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签、和/或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点中的一条或多条序列组成的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽选自：(1)在SEQIDNO:2所示氨基酸序列第150、222、285和291位中的至少一个位置上具有取代突变的多肽；和(2)由(1)所示的多肽与促进(1)所示的多肽表达与纯化的多肽组成的多肽；优选地，所述多肽在SEQIDNO:2所示氨基酸序列第150和291位具有取代突变；或所述多肽在第222和285位具有取代突变；更优选地，所述多肽是氨基酸序列如SEQIDNO：4或6所示的多肽；或所述多肽是如SEQIDNO：4或6所示的氨基酸序列与选自信号肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签、和/或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点中的一条或多条序列组成的多肽。2.一种多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列选自：(1)编码权利要求1所述的多肽的多核苷酸；(2)与(1)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸；和(3)(1)或(2)所述的多核苷酸的长10-40个碱基的片段；优选地，所述多核苷酸的序列如SEQIDNO：3或5所示。3.一种多核苷酸构建物，其特征在于，所述多核苷酸构建物含有权利要求2所述的多核苷酸序列；优选地，所述多核苷酸构建物是表达载体或克隆载体。4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞：(1)表达权利要求1所述的多肽；和/或(2)含有权利要求2所述的多核苷酸序列或权利要求3所述的多核苷酸构建物。5.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1所述的多肽或权利要求4所述的遗传工程化的宿主细胞和任选的辅料，优选地，所述辅料为选自树脂、活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃的吸附材料。6.权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的多核苷酸序列、权利要求3所述的核酸构建物、权利要求4所述的遗传工程化的宿主细胞或权利要求5所述的组合物在酯化反应、酯的水解反应、酯交换反应中的应用，特别是在油脂精炼、油品化工、食品工业、医药卫生、化学化工中的应用，具体地在油脂脱酸或生物柴油制备中的应用。7.一种生物柴油的制备方法或一种油脂脱酸的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的多肽进行酯化反应或酯交换反应的步骤；优选地，包括混合含羧酸基化合物的油脂和含羟基的化合物，在权利要求1所述多肽和任选的水的存在下进行反应的步骤；更优选地，所述含羟基化合物是有机醇或单甘酯；和/或更优选地所述含羧酸基化合物的油脂指酸价超过国家标准的食用油脂；和/或更优选地所述含羧酸基化合物的油脂选自：毛油、部分精炼的油脂、餐饮废油、粗油酸、酸化油、或PFAD与脂肪酸酯的混合物。8.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴小军，徐正军，周美凤，牛其文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31