一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种多肽，其结构式如下所示，

Polypeptide and polypeptide -siRNA induced co assembly and uses thereof

The invention provides a polypeptide, and its structural formula is as follows.

【技术实现步骤摘要】
一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种多肽，具体来说是一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途。
技术介绍
RNAi技术是最广泛应用的生物学技术之一，由于RNAi技术对特定基因mRNA的高度特异性和高效性表达调控。因此，RNAi技术被广泛的用于功能基因组学、遗传学、基因治疗、病毒性疾病治疗等许多领域。然而，无论在体内还是体外，siRNA都很容易被广泛存在的RNase降解，并且siRNA无法单独穿过细胞膜引发RNAi效应，因此，RNAi技术离不开高效，低毒的siRNA运载体的帮助。常用的siRNA转染载体有病毒载体、脂质体、高聚物、无机纳米粒子、多肽生物载体等。其中病毒载体是一类以腺病毒、逆转录病毒和慢病毒为主的siRNA载体。病毒载体是已知的转染效率最高的siRNA载体之一，但是因为病毒有可能不可控的插入宿主的基因组中，因此，出于安全性和操作复杂性的考虑，病毒类载体的应用受到了很大的限制。以脂质体和高聚物为代表的一类化学修饰载体是目前应用最广泛的一类siRNA载体。其中脂质体(如:lipo-2000)是由一个亲水性的头部和一个疏水性的尾部组成的两亲性分子，脂质体在水中可以与siRNA形成均一稳定的复合物，将siRNA包裹在有脂质体分子组成的空腔内，并通过内吞或者膜融合的方式进入细胞，并进一步释放出内部的siRNA分子，引发RNAi效应。但是，由于脂质体自身对于细胞膜有较强的细胞毒性，有脂质体介导的siRNA转染一般在较低的脂质体浓度下进行，并且主要限制在体外和细胞水平的转染。以聚乙烯亚胺PEI和PLL等阳离子聚合物为代表的高聚物是另一类广泛应用的siRNA运载体，PEI分子利用静电作用负载包裹siRNA，通过内吞作用进入细胞后，利用质子海绵效应使内吞体破裂，促进siRNA的释放。随着PEI分子量的增大，能够负载的siRNA的含量也越多，但同时细胞毒性也越大。因此对于PEI分子，再未进一步优化之前，一般只用于低剂量的细胞水平的转染。无极金属纳米粒子是一种以纳米金为代表的新型siRNA载体。其主要通过静电相互作用与siRNA结合，通过内吞作用进入细胞内，并成功释放，引发RNAi效应。其转染效率较高，并且对细胞没有急性毒性作用，但是由于无机金属纳米粒子太过稳定，很难被生物体清除，易导致金属纳米粒子在体内的堆集，引发潜在的毒性反应，从而极大的限制其应用。这些载体虽然都可以实现siRNA的有效的转染，但同时也存在着各自的问题，对于复杂体系内的siRNA运载，依然有许多限制和无法实现的困难。方便，简单，高效，安全的siRNA运载方式依然是科研工作者关注的方向。多肽作为生物体内的一种内源性分子，具有非常高的生物相容性和低细胞毒性。目前，通过合理设计多肽的序列及其结构，我们可以得到具有低毒性，可降解，高转染效率的多肽siRNA载体。多肽载体的出现为siRNA技术的发展提供了新的方向和活力。多肽siRNA运载体主要包括穿膜肽载体和两亲性多肽载体两大类，其中穿膜肽载体主要利用多肽的正电性与穿膜性，将负点性的siRNA通过共价交联或静电吸附的方式负载，然后通过内吞作用进入细胞，引发RNAi效应。两亲性多肽是另一类广泛应用的多肽siRNA运载体，其主要利用RNA结合蛋白的序列和穿膜肽的序列来实现负载siRNA并运载入细胞的过程。然而，为了增加多肽载体的运载效率，多肽分子往往修饰有一些特殊的基团，如：对还原环境敏感的S-S键，对PH敏感的三氯喹啉等。虽然这些修饰可以提高多肽运载siRNA的效率，但是同时也带来了制备合成和纯化分离的不便，并且多肽载体的长度一般都在20个氨基酸以上，这进一步增加了合成与分离的难度，限制了多肽siRNA载体的应用。因此，开发新型简便，安全，高效的多肽siRNA载体一直是科研工作者关注的方向。
技术实现思路
针对现有技术中siRNA运载体存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途，所述的这种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途要解决现有技术中的siRNA运载体制备和纯化繁琐、毒性高、效果不佳的技术问题。本专利技术提供了一种多肽，其结构式如下所示，其中，R为精氨酸、M为甲硫氨酸、E为谷氨酸、H为组氨酸、W为色氨酸。本专利技术还提供了一种多肽-siRNA诱导共组装体，由上述的多肽和siRNA组成。本专利技术还提供了上述的多肽-siRNA诱导共组装体在细胞运载中的用途。本专利技术还提供了上述的述的多肽-siRNA诱导共组装体在制备治疗宫颈癌的药物中的用途。本专利技术提供了一种基于核酸诱导共组装的短肽分子，该分子可以与siRNA在常温下发生共组装，形成稳定的纳米粒子并实现对siRNA分子的细胞内运载，引起RNAi效应，达到下调靶标基因mRNA表达量的目的。该短肽分子合成简便，只有9个氨基酸，适合大量制备，该专利技术有益于解决多肽siRNA运载体制备和纯化繁琐的问题，同时为开发简便，低毒，高效的多肽siRNA运载体提供了新的方向。本专利技术是一种基于核酸分子(单链RNA，双链RNA，单链DNA，双链DNA，质粒，单核苷酸分子等)存在下诱导共组装的多肽分子Wpc。本专利技术的多肽在与siRNA形成共组装纳米粒子后将载体siRNA递送至目的细胞，引发RNAi效应，实现对靶标基因mRNA的调控的作用。将本专利技术多肽与目标siRNA在常温下混合孵育5min后，即可形成稳定均一的纳米粒子，通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜可以明显观测到多肽将荧光标记的siRNA高效地运载入细胞中。通过RT-PCR分析进一步验证了共组装纳米粒子可以在细胞内引发RNAi效应，实现目的基因mRNA含量的下调。细胞毒性实验证明这种共组装纳米粒子具有较高的生物相容性，其细胞毒性和溶血毒性都很低。抗细胞增殖实验是细胞周期实验进一步证实了，多肽-siRNA(Survivin基因)纳米粒子可以有效地将宫颈癌细胞系HeLa阻断在G2期，阻滞其生长。并且人源异种宫颈癌肿瘤模型证明该多肽-siRNA(Survivin基因)能够很好的抑制宫颈癌瘤体的增殖。本专利技术通过原子力显微镜(AFM)，扫描隧道显微镜(SEM)，动态光粒径散射仪(DLS)，流式细胞术，激光共聚焦显微成像，RT-PCR分析，细胞毒性实验(MTT)，人源异种宫颈癌肿瘤移植模型等实验，证实该多肽可以在核酸分子的诱导下形成稳定均一的多肽-核酸(如：siRNA)复合纳米粒子，形成的复合纳米粒子可以递送siRNA进入目的细胞，释放并进一步引发RNAi效应。可以作为一种新型简便，低毒，高效的多肽siRNA运载体。此外，基于此多肽运载体运载针对宫颈癌细胞的关键基因survivin的mRNA可以抑制小鼠人源异植宫颈癌癌肿瘤的生长。本专利技术的多肽分子不需要引入任何非天然修饰，仅靠多肽序列中存在的两个Met分子，与关环试剂(双卤代烃)在水(含1％的甲酸)中反应12h，既可以增加多肽的正电性和稳定性。并且这种在侧链上的修饰可以在还原环境中消除(如：细胞内)，因此，多肽上增加的正电荷可以增强多肽与负点性siRNA的结合，有助于生成多肽-siRNA复合物，保护siRNA免受RNase降解。同时，当多肽-siRNA复合物进入细胞后，细胞内的还原环境会消除多肽的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其特征在于：结构式如下所示，

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于：结构式如下所示，2.一种多肽-siRNA诱导共组装体，其特征在于：由权利要求1所述的多肽和siRNA组成。3.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李子刚，尹丰，李文君，王冬园，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东,44