检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒，该方法包括：(a)获取至少一装载有核酸的芯片和至少一已知序列，该已知序列与核酸上的部分序列互补；形成互补后，核酸在沿已知序列的延伸方向上紧接有两个特异的待测碱基，第一个碱基与待检测的可逆性阻断dNTP互补，第二个碱基与带荧光的dNTP互补；(b)在DNA聚合酶的作用下，首先至少加入待检测的可逆性阻断dNTP，使已知序列延伸一个碱基；然后加入带荧光的dNTP，使至少部分序列继续延伸一个碱基；(c)采集反应后产物的荧光信号，并根据荧光信号的强度推算出待检测的可逆性阻断dNTP中非阻断杂质的含量。本发明专利技术的方法能够进一步评估可逆性阻断dNTP的纯度，并且精确度更高。

Method and kit for detecting reversible blocking of non blocking impurities in dNTP

The present invention discloses a method and kit for detecting the non blocking impurity content in dNTP, which includes: (a) obtaining at least one chip loaded with nucleic acid and at least one known sequence, the known sequence complemented with a partial sequence on the nucleic acid; after complementation, the nucleic acid is tightened along the extended direction of the known sequence. With two specific bases, the first base is complementary to the reversible blocking dNTP to be detected, and the second bases are complementary to the fluorescent dNTP; (b), under the action of DNA polymerase, first, at least the reversible blocking dNTP to be detected is added to the known sequence to extend a base, and then the fluorescent dNTP is added to at least The partial sequence continues to extend a base; (c) the fluorescence signal of the product after the reaction is collected, and the content of the non blocking impurity in the reversible blocking dNTP is calculated according to the intensity of the fluorescence signal. The method of the invention can further evaluate the purity of reversible blocking dNTP and has higher accuracy.

【技术实现步骤摘要】
检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒
本专利技术涉及测序
，尤其涉及一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒。
技术介绍
近年来，在基因测序
，与其它测序方法相比，边合成边测序(sequencingbysynthesis,SBS)的测序方法以其通量高、价格低而获得青睐。在这一测序方法中，可逆性阻断dNTP是测序的中心也是测序成本最主要和最影响测序质量的一环。在加入每个可逆性阻断dNTP后，3’阻断基团的存在阻止其它核苷酸加入合成的链中。在去除阻断基团后，恢复天然游离的3’羟基基团用于加入下一个核苷酸。但是如果由于合成或者存储等步骤导致非常少量的3′阻断基团脱落，就会增加测序的定相(Phasing)和预定相(Prephasing)，所谓“定相(Phasing)”是指SBS中的现象，该现象由3’阻断基团和荧光基团的不完全除去引起，不能通过聚合酶在给定的测序循环中将DNA链的一部分完全并入到合成链中。“预定相(Prephasing)”是由在不存在有效的3’阻断基团的情况下，核苷酸并入所引起的，并且该并入事件预先进行了1个循环。这使测序过程移相发生的更严重、更快，从而降低读长，增加错误率，降低测序质量。这在不同的测序平台上都有体现。可逆性阻断dNTP，在核苷酸糖基的3'位连一个叠氮基团(结构式是-CH2N3)或硫硫键、烯丙基作为3’阻断基团。这个3’阻断基团在链延伸时起到阻止聚合的作用。其中，叠氮基团有一个特性，就是遇到巯基试剂(例如，二巯基丙醇)，会发生断裂，并在原来的位置留下一个羟基。叠氮基团在常温下不是很稳定，尤其是3'位的叠氮基脱落，是导致测序时预定相的主要原因。因此，可逆性阻断dNTP的纯度对二代测序的质量有极大影响。可逆性阻断dNTP目前使用HPLC(高效液相色谱法)进行提纯，纯度一般能达到99.0％以上。尽管经过HPLC提纯的可逆性阻断dNTP，纯度达到99.0％以上，在测序过程中，由于各种因素比如叠氮基团在常温下不是很稳定，尤其是3'位的叠氮基脱落，从而导致预定相，影响测序质量，因此需要设计一种质控可逆性阻断dNTP的方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒，能够进一步评估可逆性阻断dNTP的纯度。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法，包括：(a)获取至少一装载有核酸的芯片和至少一已知序列，该已知序列与上述核酸上的部分序列互补；形成互补后，上述核酸在沿上述已知序列的延伸方向上紧接有两个特异的待测碱基，第一个碱基与待检测的可逆性阻断dNTP互补，第二个碱基与带荧光的dNTP互补；(b)在DNA聚合酶的作用下，首先至少加入上述待检测的可逆性阻断dNTP，使上述已知序列以上述核酸为模板延伸一个碱基；然后加入上述带荧光的dNTP，使延伸一个碱基后的序列中的至少部分序列继续延伸一个碱基；(c)采集反应后的产物的荧光信号，并根据上述荧光信号的强度推算出上述待检测的可逆性阻断dNTP中非阻断杂质的含量。进一步地，上述两个特异的待测碱基是不同的碱基。进一步地，上述推算依据标准曲线进行，上述标准曲线包括自然dNTP的浓度与上述浓度对应的荧光信号强度的函数关系，其中上述自然dNTP与上述第一个碱基互补。进一步地，上述标准曲线的R2≥0.95。进一步地，上述方法还包括制作上述标准曲线的步骤：(d)在DNA聚合酶的作用下，首先加入不同浓度的上述自然dNTP，使上述已知序列以上述核酸为模板延伸一个碱基；然后加入上述带荧光的dNTP，使延伸一个碱基后的序列中至少部分序列继续延伸一个碱基；(e)采集反应后的产物的荧光信号，并根据上述自然dNTP的浓度与上述荧光信号的强度关系制作上述标准曲线。进一步地，上述步骤(d)与上述步骤(b)同步进行；上述步骤(e)与上述步骤(c)同步进行。进一步地，上述步骤(b)和上述步骤(c)至少重复三次，上述非阻断杂质的含量是所有重复结果的平均值。进一步地，上述步骤(b)还包括加入已知浓度的自然dNTP，上述自然dNTP与上述第一个碱基互补。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的试剂盒，包括：至少一装载有核酸的芯片，至少一已知序列，带荧光的dNTP，DNA聚合酶；其中，上述已知序列与上述核酸上的部分序列互补；形成互补后，上述核酸在沿上述已知序列的延伸方向上紧接有两个特异的待测碱基，第一个碱基与待检测的可逆性阻断dNTP互补，第二个碱基与上述带荧光的dNTP互补；上述已知序列用于在上述DNA聚合酶的作用下，以上述核酸为模板、利用上述待检测的可逆性阻断dNTP延伸一个碱基；上述带荧光的dNTP用于使延伸一个碱基后的序列中至少部分序列继续延伸一个碱基，以便采集反应后的荧光信号并推算出上述待检测的可逆性阻断dNTP中非阻断杂质的含量。进一步地，上述试剂盒还包括：自然dNTP，其与上述第一个碱基互补，用于在DNA聚合酶的作用下，使上述已知序列以上述核酸为模板延伸一个碱基，以便上述带荧光的dNTP使延伸一个碱基后的序列中至少部分序列继续延伸一个碱基，进而采集反应后的荧光信号并制作上述荧光信号与上述自然dNTP浓度的标准曲线。本专利技术的检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法，以装载有核酸的芯片为载体，使用与核酸上的部分序列互补的已知序列作为延伸引物，利用有效的可逆性阻断dNTP加入已知序列后阻止后续带荧光的dNTP加入的特性，以及非阻断杂质或自然dNTP加入已知序列后不能阻止后续带荧光的dNTP加入的特性，建立起非阻断杂质或自然dNTP含量与荧光信号强度的线性关系，从而根据荧光信号强度推算出非阻断杂质含量。能够进一步评估可逆性阻断dNTP的纯度，并且精确度更高。附图说明图1为本专利技术实施例的检测可逆性阻断dATP的流程和原理图；图2为本专利技术实施例的dATP浓度与均一化荧光信号的标准曲线图；图3为本专利技术实施例的dCTP浓度与均一化荧光信号的标准曲线图；图4为本专利技术实施例的dTTP浓度与均一化荧光信号的标准曲线图；图5为本专利技术实施例的dGTP浓度与均一化荧光信号的标准曲线图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。可逆性阻断dNTP是指脱氧核糖的3’端被阻断基团阻断的dNTP。本专利技术实施例中，阻断基团可以是任何本领域中用于阻断dNTP的3′羟基的基团，典型单非限定性的包括叠氮亚甲基。其它的可用阻断基团还包括例如国际申请WO2014139596A1中公开的那些阻断基团。本专利技术对阻断基团的种类没有特别限定，根据本专利技术的原理，任何本领域中用于阻断dNTP的3′羟基的基团都可以作为本专利技术中的阻断基团。这些阻断基团都能够可逆地从dNTP上脱落下来，因此会存在非阻断杂质(正常的dNTP)，这些非阻断杂质会导致测序过程中，每个循环本应合成一个碱基，却合成二个或更多的碱基，即所谓预定相现象。因此，本专利技术的目的在于，提供一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法，以精确定量可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量，进而评估预定相的严重程度。请参考图1，本专利技术实施例以检测可逆性阻断dATP中非阻断杂质(正常的dATP)含量为例，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)获取至少一装载有核酸的芯片和至少一已知序列，该已知序列与所述核酸上的部分序列互补；形成互补后，所述核酸在沿所述已知序列的延伸方向上紧接有两个特异的待测碱基，第一个碱基与待检测的可逆性阻断dNTP互补，第二个碱基与带荧光的dNTP互补；(b)在DNA聚合酶的作用下，首先至少加入所述待检测的可逆性阻断dNTP，使所述已知序列以所述核酸为模板延伸一个碱基；然后加入所述带荧光的dNTP，使延伸一个碱基后的序列中的至少部分序列继续延伸一个碱基；(c)采集反应后的产物的荧光信号，并根据所述荧光信号的强度推算出所述待检测的可逆性阻断dNTP中非阻断杂质的含量。

【技术特征摘要】
1.一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)获取至少一装载有核酸的芯片和至少一已知序列，该已知序列与所述核酸上的部分序列互补；形成互补后，所述核酸在沿所述已知序列的延伸方向上紧接有两个特异的待测碱基，第一个碱基与待检测的可逆性阻断dNTP互补，第二个碱基与带荧光的dNTP互补；(b)在DNA聚合酶的作用下，首先至少加入所述待检测的可逆性阻断dNTP，使所述已知序列以所述核酸为模板延伸一个碱基；然后加入所述带荧光的dNTP，使延伸一个碱基后的序列中的至少部分序列继续延伸一个碱基；(c)采集反应后的产物的荧光信号，并根据所述荧光信号的强度推算出所述待检测的可逆性阻断dNTP中非阻断杂质的含量。2.根据权利要求1所述的检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法，其特征在于，所述两个特异的待测碱基是不同的碱基。3.根据权利要求1所述的检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法，其特征在于，所述推算依据标准曲线进行，所述标准曲线包括自然dNTP的浓度与所述浓度对应的荧光信号强度的函数关系，其中所述自然dNTP与所述第一个碱基互补。4.根据权利要求3所述的检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法，其特征在于，所述标准曲线的R2≥0.95。5.根据权利要求3或4所述的检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法，其特征在于，所述方法还包括制作所述标准曲线的步骤：(d)在DNA聚合酶的作用下，首先加入不同浓度的所述自然dNTP，使所述已知序列以所述核酸为模板延伸一个碱基；然后加入所述带荧光的dNTP，使延伸一个碱基后的序列中至少部分序列继续延伸一个碱基；(e)采集反应后的产物的荧光信号，并根据所述自然dNTP的浓度与所述荧光信号的强度关系制作所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚梅花，王静静，罗银铃，罗宇芬，李长英，陈奥，徐崇钧，章文蔚，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44