一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒与应用。该试剂盒包括如SEQ ID NO:1～6所示核苷酸序列的6条引物。本发明专利技术还提供了用于检测绿脓杆菌的试剂盒，以及非诊断目的检测绿脓杆菌的方法。经试验证明，本发明专利技术提供的引物进行绿脓杆菌检测，准确性可达100％。且利用临床常见细菌作为对照检测的过程中，无假阳性现象产生。并且，本发明专利技术提供的引物在绿脓杆菌检测中，灵敏度可达10pg/μL。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒与应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒与应用。
技术介绍
绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)亦称铜绿假单胞菌。是一种常见的条件致病菌，自然界广泛分布于空气、水和土壤中，也可存在于人体器官表面，可污染常用眼药，作为一种条件致病菌，当角膜上皮遭到损害，机体免疫功能低下时，绿脓杆菌可直接侵入角膜，引起绿脓杆菌性角膜炎。绿脓杆菌性角膜溃疡是一种非常严重的化脓性角膜炎，多因角膜外伤或剔除角膜异物术感染所致。其特点是角膜刺激症状极重，多呈环状中央溃疡，表面有淡绿色脓液，前房多有积脓，短期内可致角膜穿孔，易引起眼内炎、视力丧失。伤后数小时或1～2天内发病，症状严重，发展迅猛，若不及时控制，本病一旦发生，患眼不但常失去视力，而且还有丧失眼球的危险。绿脓杆菌性角膜溃疡属眼科急重症，临床主要特点是潜伏期短、发展快、症状重、易穿孔并致盲。因此及时有效的诊断方式对治疗本症至关重要。目前，常用的绿脓杆菌检测方法有：细菌培养法、基因芯片法、ELISA法、PCR法、荧光定量PCR法等。细菌培养法耗时长及其繁琐的步骤是该方法发展难以突破的瓶颈。通常一次培养需要1-3天，耗时费力，易贻误诊断治疗的最佳时机；基因芯片法能对同一致病菌进行多基因位点检测，避免了单一位点检测的缺陷，大大降低假阳性，具有高灵敏度、高特异性的优点，但最大的缺点是成本太高；ELISA法虽然操作简单，较为便捷，但敏感性和特异性差，容易出现假阳性。PCR法或荧光定量PCR法具有较好的敏感性、特异性，是目前所有绿脓杆菌检测方法中最为精确的方法，但这两种方法都需要昂贵的专业仪器设备和试剂，操作步骤复杂，实验费时、费力，对人员技术要求高，不能方便的在临床开展。可见，目前常用的几种绿脓杆菌检测方法已经不能满足日常门诊的快速诊断或基层医疗机构使用。而由于这些方法的局限，目前眼科临床的现状是大部分患者没有经过准确的病原微生物检测，只凭医生的经验进行诊断治疗，导致抗生素使用较混乱、增加了医疗成本和医疗风险。因此，急需开发一种敏感性高、特异性强，操作简便快捷、检测准确，成本较低的检测绿脓杆菌的方法。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是2000年日本荣研化学株式会社开发的替代PCR核酸扩增方法。该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，LAMP反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人员也可准确完成，适合基层医疗机构的应用。并且，LAMP还可以大大缩短操作时间，减少了样品污染机会，适合应用于绿脓杆菌的快速诊断。但是，由于LAMP的灵敏度和特异性极度依赖于引物的特性，然而良好的LAMP引物不易获得，因此，目前还未见基于LAMP技术对绿脓杆菌样品直接检测的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒与应用，本专利技术提供的引物灵敏度和特异性皆很高，将其制备成为试剂盒可实现对绿脓杆菌快速准确的检测。本专利技术提供了一种LAMP引物组，包括如SEQIDNO:1～6所示核苷酸序列的6条引物。本专利技术提供的LAMP引物组针对绿脓杆菌的特异保守区域(靶基因)，由6条引物组成，包括序列如SEQIDNO:1～2所示的内引物(FIP/BIP)、序列如SEQIDNO:3～4所示的外引物(F3/B3)和序列如SEQIDNO:5～6所示的环引物(LPF/LPB)。其中，FIP/BIP分别为上下游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。F3/B3分别为上下游外部引物，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。LF/LB分别为上下游环引物，与扩增过程中形成的茎环结构结合的区域在F2和F1之间。这样的设计可以保证引物具有更高的特异性，从而避免在检测过程中出现假阳性。本专利技术还提供了SEQIDNO:1～6所示核苷酸序列的引物组在制备检测绿脓杆菌试剂中的应用。本专利技术提供的引物组可用于判断待测样品是否受到绿脓杆菌的污染。所述待测样品为眼部样品、医疗器械、药品、食品、化妆品、皮肤、分泌物或口腔黏膜。所述药物为眼部用药：具体包括染色剂类，麻醉剂类、消炎抗生素类、皮质类固醇激素类、抗青光眼类、散瞳类。染色剂类：如荧光素钠，用于角膜、结膜损伤及异物的术前检查。麻醉剂类：如地卡因，这是做眼科检查前必用的，也是很多角膜损伤必用的药物，也用于眼科表面麻醉。消炎抗生素类：如利福平，主要适用于眼睑、泪道、结膜、角膜等部位的感染性炎症，或手术后感染的预防与治疗。皮质类固醇激素类：如可的松，主要适用于过敏性炎症、内因性非感染性炎症以及外伤、手术后反应性炎症，也可以用于近视眼手术后。抗青光眼类：如匹罗卡品。散瞳类：如阿托品，主要用于验光、眼底等散瞳检查，也可用于严重的角膜炎、虹膜睫状体炎和手术前后。具体的，眼部用药为：荧光素钠、地卡因、氢化可的松、阿托品、匹罗卡品、利福平等。实验表明，本专利技术提供的引物在对药物是否感染绿脓杆菌进行检测的过程中，不受药物组分的干扰。作为优选，眼部样品为眼睑组织、角膜组织、泪液、房水或玻璃体腔液。本专利技术提供的引物可实现对待测物的直接检测，而不需对待测样品进行DNA的提取。本专利技术还提供了一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒，包括本专利技术提供的LAMP引物组。作为优选，本专利技术提供的用于检测绿脓杆菌的试剂盒还包括：LAMP反应液、LAMP密封液和LAMP显色液。优选的，LAMP反应液中包括：Bst聚合酶，LAMP反应缓冲液，超纯水。更优选的，LAMP反应缓冲液中包括：硫酸镁、甜菜碱、dNTP、Tris-HCl、超纯水。优选的，LAMP密封液为甘油。优选的，LAMP显色液中包括SYBRgreenI或钙黄绿素。本专利技术还提供了一种非诊断目的的绿脓杆菌检测方法，该方法以待测样品为模板，以本专利技术提供的引物组进行LAMP扩增，经显色后，根据显色结果判断样品是否含有绿脓杆菌。所述LAMP扩增的温度为65℃，时间为30min。具体的，该方法包括以下步骤：步骤1：取待测样品与灭菌生理盐水混合，获得样品混悬液；取如权利要求1所述的引物组与水混合，制得引物组工作液；步骤2：取所述样品混悬液、所述引物组工作液与LAMP反应液、超纯水、LAMP密封液混合，制得扩增反应液；步骤3：取所述扩增反应液，65℃反应30min，显色，根据显色结果判断样品是否含有绿脓杆菌。所述待测样品可为提取获得的DNA样品，也可不经提取，仅将样品与灭菌生理盐水混合后的样品混悬液。作为优选，显色采用LAMP显色液，其中包含SYBRgreenI或钙黄绿素，显色结果呈现绿色则待测样品中含有绿脓杆菌，不呈现绿色则待测样品中不含有绿脓杆菌。不呈现绿色的情况包括：显色结果为橙色、其它颜色或无色。作为优选，待测样品为眼部样品、医疗器械、药品、皮肤、分泌物或口腔黏膜。作为优选，LAMP扩增的反应液中，引物组工作液、LAMP反应液、样品混悬液、超纯水和LAMP密封液的体积比为1:12.5:2:(8.5～10.5):本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LAMP引物组，其特征在于，包括如SEQ ID NO:1～6所示核苷酸序列的6条引物。

【技术特征摘要】
1.一种LAMP引物组，其特征在于，包括如SEQIDNO:1～6所示核苷酸序列的6条引物。2.如权利要求1所述的引物组在制备检测绿脓杆菌试剂中的应用。3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述眼部检测的样品为眼部样品、医疗器械、药品、食品、化妆品、皮肤、分泌物或口腔黏膜。4.一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的LAMP引物组。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括：LAMP反应液、LAMP密封液和LAMP显色液。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液中，包括：Bst聚合酶，LAMP反应缓冲液，超纯水。7.一种非诊断目的的绿脓杆菌检测方法，其特征在于，以待测样品为模板，以如权利要求1所述的引物组进行LAMP扩增，经显色后，根据显色结果判断样品是否含有绿脓杆菌。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增的温度为65℃时间为30min。9.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卓实，赵艳，高飞，
申请(专利权)人：何伟，
类型：发明
国别省市：辽宁,21