自身免疫性肝炎的诊断试剂盒及相关基因在制备该试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于诊断自身免疫性肝炎(AIH)的基因标志物及其试剂盒，利用所述基因标志物可以快速、有效的诊断自身免疫性肝炎(AIH)。

【技术实现步骤摘要】
自身免疫性肝炎的诊断试剂盒及相关基因在制备该试剂盒中的应用
本专利技术属于疾病研究领域，具体涉及自身免疫性肝炎(AIH)的诊断标志物及其试剂盒的开发。
技术介绍
自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis，AIH)是一种由异常自身免疫反应介导的慢性炎症性肝脏疾病，以血清自身抗体阳性、转氨酶水平和免疫球蛋白G水平升高、组织学上表现为界面性肝炎为临床特点。一般而言，AIH患者对免疫抑制剂应答良好，然而如不治疗可进展为肝硬化、肝功能衰竭。目前，尚缺乏我国AIH流行病学确切的资料。近年来，随着对AIH诊断和认识水平的不断提高，我国AIH患者检出率逐年升高。AIH已成为非病毒性肝病的重要组成部分，日益受到人们的关注。AIH的病因和发病机制尚未完全阐明，并发症和伴发病多，尚无特效治疗，病程经过呈慢性、波动性。前瞻性研究显示，未经治疗的严重AIH患者在诊断后半年内的死亡率高达40％，幸存者中有40％发展为肝硬化，54％的患者在肝硬化2年内出现食管静脉曲张，最终有20％的患者死于食管静脉曲张破裂引起的大出血。因此及时诊断，并给予合理恰当的治疗，对于延缓或逆转此病有非常重要的意义。AIH的诊断有一定难度，需要有特征性表现的存在，易导致漏诊或误诊；同时需要排除其他的情况，特别是病毒性肝炎。而诊断为病毒性肝炎的也不乏其人，特别是急性起病时，更易误诊随着丙型病毒性肝炎的被证实，增加了AIH诊断的不确定性。丙肝患者常常表现出与AIH相似的特征。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，从遗传易感性的角度来阐述AIH的发病机制逐渐成为研究的热点。人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)是已知的最重要的AIH遗传风险因子。HLA区域和AIH的相关性在不同地区和人群中被广泛研究，是目前证据最确凿的易感基因。我国AIH遗传学研究尚处于起步阶段，与西方国家研究水平存在较大差距。在中国人群中开展全基因组、大样本、反复验证的遗传学研究具有重要意义，不但有助于发现新的、中国人群特异的AIH易感基因，还可为进一步揭示疾病的发病机制和个性化诊疗提供依据。我们利用高通量转录组测序筛选与AIH密切相关的基因，不仅有利于研究AIH的发生和发展的病理机制，而且能为诊断和治疗AIH提供新的诊断标志物或新的药物靶点。
技术实现思路
为了弥补现有技术中自身免疫性肝炎(AIH)缺乏特异性的临床表现及生化指标、在临床工作中诊断存在一定困难的缺陷，本专利技术提供一种可用于AIH疾病诊疗的标志物基因。相比传统的AIH疾病的诊断和治疗方法，使用基因标志物来诊断和治疗AIH疾病具有及时性、特异性和无创性。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：提供一种诊断自身免疫性肝炎(AIH)的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含通过检测受试者外周血中KCNIP2基因、C16orf54基因和IL21基因的表达水平来判断受试者是否患有自身免疫性肝炎的试剂。优选的，所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR或基因芯片诊断自身免疫性肝炎的试剂。所述用于RT-PCR或实时定量PCR的试剂为如下引物：KCNIP2：正向引物为5’-GACAGTTCGCTCCCTTCAG-3’(SEQIDNO：1)；反向引物为5’-CCCCGAAGAATCACGGACA-3’(SEQIDNO：2)；C16orf54：正向引物为5’-CCAGAGCCACAAATCCTGT-3’(SEQIDNO：5)；反向引物为5’-TAGGACAACGCTCCTCTCCA-3’(SEQIDNO：6)；IL21：正向引物为5’-GGACACTGGTCCACAAAT-3’(SEQIDNO：7)；反向引物为5’-GTTGGGCCTTCTGAAAGCAG-3’(SEQIDNO：8)。进一步的，所述试剂盒还包含内参基因的扩增引物：β-actin：正向引物为5’-ATCCTGCGTCTGGACCT-3’(SEQIDNO：9)；β-actin：反向引物为5’-ACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’(SEQIDNO：10)。本专利技术还提供用于检测KCNIP2基因、TNFSF15基因和IL21基因的表达水平的试剂在制备用于诊断自身免疫性肝炎的试剂盒中的应用。所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR或基因芯片检测所述基因的试剂。所述用于RT-PCR或实时定量PCR的试剂为SEQIDNO：1-2、5－8所示引物。本专利技术通过高通量测序筛选获得了在自身免疫性肝炎(AIH)的表达显著上调或下调的基因，通过对这些基因进行进一步的筛选和验证，从中确定了3个能够用于诊断或预测个体是否患有AIH的基因标志物组合，这一组合的获得为AIH的诊断带来了极大的便利，有利于AIH的早期诊断、早期治疗。附图说明图1为提取的总RNA的电泳图。图2为PCR验证候选基因在自身免疫性肝炎(AIH)中的表达改变情况。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。实施例1：筛选与自身免疫性肝炎(AIH)相关的基因1、样品收集收集医院诊断为自身免疫性肝炎(AIH)的患者25例，健康对照组(healthcontrol，HC)选取与AIH组年龄、性别匹配的健康志愿者25例。全部25例健康对照年龄和性别与AIH组匹配，无既往肝病史、肿瘤病史及相应家族史。2、RNA样品的制备及质量分析2.1RNA样品的制备(1)AIH患者和健康志愿者，每人采集外周静脉血10ml，EDTA抗凝。(2)抽提外周血单个核细胞(PBMC)：Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。(3)分离PBMC的总RNA：Trizol一步法提取PBMC总RNA。2.2RNA样品的质量分析NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28SrRNA和18SrRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。部分样品的RNA分析图像如图1所示。此类图像的RNA属于符合要求的RNA样品。3、高通量转录组测序3.1测序文库的建立用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA后，用片段化缓冲剂(Fragmentbuffer)将其打断成短片段，以mRNA为模板用6碱基随机引物合成第1条cDNA链，再加入缓冲液、RNaseH、dNTPs和DNApolymeraseI合成第2条cDNA链，再用QiaQuiekPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱；在做末端修复和加poly(A)并连接测序接头后，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建立测序文库。3.2测序测序用IlluminaHiSeq2000进行文库的测序，由深圳华大基因科技有限公司测序。3.3转录丰度评估及差异基因的获得用组装软件Trinity对转录组从头组装。首先SOAPdenovo程序将reads通过片段重叠连成更长的片段叫Contig；再将Contig连在一起得到两端不能再延长的序列Unigene，再对其做去冗余处理、进一步拼接、同源转录本聚类，得到最本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诊断自身免疫性肝炎(AIH)的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含通过检测受试者外周血中KCNIP2基因、C16orf54基因和IL21基因的表达水平来判断受试者是否患有自身免疫性肝炎的试剂。

【技术特征摘要】
1.一种诊断自身免疫性肝炎(AIH)的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含通过检测受试者外周血中KCNIP2基因、C16orf54基因和IL21基因的表达水平来判断受试者是否患有自身免疫性肝炎的试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR或基因芯片诊断自身免疫性肝炎的试剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述用于RT-PCR或实时定量PCR的试剂为如下引物：KCNIP2：正向引物为5’-GACAGTTCGCTCCCTTCAG-3’(SEQIDNO：1)；反向引物为5’-CCCCGAAGAATCACGGACA-3’(SEQIDNO：2)；C16orf54：正向引物为5’-CCAGAGCCACAAATCCTGT-3’(SEQIDNO：5)；反向引物为5’-TAGGACAACGCTCCTCTCCA-3’(SEQIDNO：6)；IL21：正向引物为5’-GGACACTGGTCCACAAAT-3’(SEQIDNO：7)；反向引物为5’-GTTGGGCCTTCTGAAAGCAG-3’(SEQIDNO：8)。4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含内参基因的扩增引物：β-actin：正向引物为5’-ATCCTGCGTCTGGACCT-3’(SEQIDNO：9)；β-actin：反向引物为5’-ACTTGCGCTCAGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：李璇，
申请(专利权)人：李璇，
类型：发明
国别省市：北京,11