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L-脯氨酸4-羟化酶制造技术

技术编号:18337838 阅读:43 留言:0更新日期:2018-07-01 10:33
本发明专利技术涉及一种L‑脯氨酸4‑羟化酶突变体,以及编码其的DNA、具有该DNA的重组载体,以及生产反式‑(2S,4R)‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法。该L‑脯氨酸4‑羟化酶突变体的序列为在SEQ ID No.:3所示的序列中具有如下突变中的一种或多种:91位从组氨酸到谷氨酰胺的突变;228位从缬氨酸到苯丙氨酸的突变;89位从酪氨酸到苯丙氨酸的突变;228位从缬氨酸到丙氨酸的突变;54位从缬氨酸到丙氨酸的突变;53位从苏氨酸到丙氨酸的突变;152位从亮氨酸到谷氨酰胺的突变;165位从天冬氨酸到谷氨酸的突变,以及第266位从苯丙氨酸到亮氨酸的突变;53位从苏氨酸到丙氨酸的突变,以及第272位从缬氨酸到异亮氨酸的突变;5位从苏氨酸到丝氨酸的突变,以及第171位从亮氨酸到谷氨酰胺的突变。

【技术实现步骤摘要】
L-脯氨酸4-羟化酶
本专利技术涉及L-脯氨酸4-羟化酶的几种突变体。
技术介绍
反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸(L-Hyp)存在于植物和动物中。在植物中和多糖小侧链结合形成糖蛋白。在动物中前胶原的脯氨酸残基羟化成羟脯氨酸。这些羟基化的残基之间的氢键用于稳定前胶原的三股螺旋。L-Hyp与脯氨酸一起从明胶水解物中分离出来。L-Hyp作为胶原的成分,是一种非必需氨基酸,并且在宜它霉素等次级代谢物中被发现。L-Hyp有C-2和C-4两个手性中心,是生产多功能吡咯烷环的原料。吡咯烷环的所有位置都可以发生替代。C-3位替代可以通过氧化成4-羟基或形成烯烃完成。C-5功能化通过这个位置的氧化反应实现也有报道。C-2和C-4的转化可以轻易实现导致所有4种可能的L-Hyp异构体。L-Hyp脱羧也是形成手性4-羟基吡咯烷的简单方法。L-Hyp可以产生大量手性分子,如谷氨酸类似物、红藻氨酸、精氨酸类似物、碳青霉烯类,自然产物如网纹马勃酸、bulgecins、ecinochandins或didemnins,以及全合成的哌啶和吡咯烷,苯(并)二氮、嘌呤霉素类似物、巴氯芬、喹诺酮类、naphthyridones等(参见REMUZONP1996.Trans-4-Hydroxy.L-ProHne,aUsefulandVersatileChiralStartingBlock.TETRAHEDRON[J],52(44):13803-13835)。
技术实现思路
L-Hyp在工业上通过水解哺乳动物胶原生产。但这种方法收率低、造成环境污染,所以需要更加绿色环保的方法。因此微生物发酵生产L-Hyp受到越来越多的关注。目前国际上通过微生物发酵生产L-Hyp的主要方法是日本协和发酵工业株式会社采用的整细胞催化方法,用表达L-脯氨酸4-羟化酶(P4H)的重组大肠杆菌整细胞催化L-脯氨酸生产羟脯氨酸,2-酮戊二酸由葡萄糖分解代谢提供,最高产量是发酵100小时产生41g/LL-Hyp(参见TAKESHISHIBASAKIHM,AKIOOZAKI2000.Enzymaticproductionoftrans-4-hydroxy-L-prolinebyregio-andstereospecifichydroxylationofL-proline.Biosci.Biotechnol.Biochem.[J],64(4):746-750.)。在哺乳动物中L-脯氨酸通过原胶原-脯氨酸双加氧酶(脯胺酰羟化酶)(EC1.14.11.2)形成。这个酶属于2-酮戊二酸依赖的双加氧酶,需要2-酮戊二酸和氧气作为共同底物及亚铁离子作为辅因子。但这个酶只接受肽基脯氨酸作为底物,不接受游离脯氨酸作底物。相反,L-脯氨酸4-羟化酶可以羟化游离L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸(L-Hyp)。有研究发现StreptomycesgriseoviridusP-8648只有在合成宜他霉素时具有L-脯氨酸4-羟化酶活性,活性只有907pmol/min每毫克蛋白,基因没有克隆。TakeshiShibasaki等筛选到具有L-脯氨酸4-羟化酶活性的Dactylosporangiumsp.StrainRH1,活性为2.31nmol/min每毫克蛋白,并克隆到该基因(参见SHIBASAKIT,MORIH,CHIBAS,etal.1999.MicrobialProline4-HydroxylaseScreeningandGeneCloning.Appl.Environ.Microbiol.[J],65(9):4028-4031)。TakeshiShibasaki将来自Dactylosporangiumsp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶基因5’端密码子优化后构建到串联色氨酸启动子的载体中,在大肠杆菌W1485中过表达。活性为46nmol/min每毫克湿细胞(参见SHIBASAKIT,MORIH,OZAKIA2000.Enzymaticproductionoftrans-4-hydroxy-L-prolinebyregio-andstereospecifichydroxylationofL-proline.Biosci.Biotechnol.Biochem.[J],64(4):746-750)。FrancescoFalcioni等将GenBank中p4h基因(accessionnumberD78338)经密码子优化后在pET-24a(Novagen)和大肠杆菌BL21(DE3)(pLysS)中表达,静息细胞、透性细胞和细胞提取物活性分别是12、28、205nmol/min每毫克细胞干重。L-脯氨酸4-羟化酶的产生依赖胞外脯氨酸的可利用性和密码子使用。增加胞内可溶蛋白水平不会增加静息细胞的活性,而透性化细胞活性增加高达5倍,说明是细胞的生理机能而不是胞内可溶蛋白水平决定整细胞羟化水平。另外P4H表达会诱导putA和putP转录水平下降导致脯氨酸摄取降低(参见FALCIONIF,BLANKLM,FRICKO,etal.2013.ProlineAvailabilityRegulatesProline-4-HydroxylaseSynthesisandSubstrateUptakeinProline-HydroxylatingRecombinantEscherichiacoli.Appl.Environ.Microbiol.[J],79(9):3091-3100)。YulanYi等将来源于Dactylosporangiumsp.RH1,和BordetellabronchisepticaRB50的L-脯氨酸4-羟化酶在大肠杆菌BL21/pET-28a中表达,活性分别为60.4、22.2、50.0nmol/min每毫克湿细胞(参见YIY,SHENGH,LIZ,etal.2014.Biosynthesisoftrans-4-hydroxyprolinebyrecombinantstrainsofCorynebacteriumglutamicumandEscherichiacoli.BMCBiotechnol[J],14:44)。L-脯氨酸4-羟化酶在大肠杆菌中表达发现形成大量无活性包涵体,给菌体生长造成负担,限制细胞催化活性。目前的研究主要集中在对密码子、表达载体和表达宿主的优化等方面,主要是为了增加目的蛋白质的表达量,但这对提高反应效率的作用非常有限。体外直接进化可以显著提高酶的稳定性、表达和活性,已成为应用最广泛和成功的提高生物催化的方法。直接进化以很低的频率随机引入广泛分布在目标基因的突变,然后筛选突变蛋白获得需要的特性。直接进化可以相对快速的对蛋白质进行改造,而不需要对结构功能关系的深入了解。直接进化的关键是开发高通量的筛选方法(参见CHICARA,DOUCETN,PELLETIERJN2005.Semi-rationalapproachestoengineeringenzymeactivity:combiningthebenefitsofdirectedevolutionandrationaldesign.CurrOpinBiotechnol[J],16:378-384)。本专利技术的发本文档来自技高网...
L-脯氨酸4-羟化酶

【技术保护点】
1.一种L‑脯氨酸4‑羟化酶,其序列为在SEQ ID No.:3所示的序列中具有如下(1)~(10)突变中的一种或多种:(1)SEQ ID No.:3中第91位氨基酸从组氨酸到谷氨酰胺的突变(H91Q);(2)SEQ ID No.:3中第228位氨基酸从缬氨酸到苯丙氨酸的突变(V228F);(3)SEQ ID No.:3中第89位氨基酸从酪氨酸到苯丙氨酸的突变(Y89F);(4)SEQ ID No.:3中第228位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V228A);(5)SEQ ID No.:3中第54位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V54A);(6)SEQ ID No.:3中第53位氨基酸从苏氨酸到丙氨酸的突变(T53A);(7)SEQ ID No.:3中第152位氨基酸从亮氨酸到谷氨酰胺的突变(L152Q);(8)SEQ ID No.:3中第165位氨基酸从天冬氨酸到谷氨酸的突变,以及第266位氨基酸从苯丙氨酸到亮氨酸的突变(D165E;F266L);(9)SEQ ID No.:3中第53位氨基酸苏氨酸到丙氨酸的突变,以及第272位氨基酸从缬氨酸到异亮氨酸的突变(T53A;V272I);(10)SEQ ID No.:3中第5位氨基酸苏氨酸到丝氨酸的突变,以及第171位氨基酸从亮氨酸到谷氨酰胺的突变(T5S;L171Q)。...

【技术特征摘要】
1.一种L-脯氨酸4-羟化酶,其序列为在SEQIDNo.:3所示的序列中具有如下(1)~(10)突变中的一种或多种:(1)SEQIDNo.:3中第91位氨基酸从组氨酸到谷氨酰胺的突变(H91Q);(2)SEQIDNo.:3中第228位氨基酸从缬氨酸到苯丙氨酸的突变(V228F);(3)SEQIDNo.:3中第89位氨基酸从酪氨酸到苯丙氨酸的突变(Y89F);(4)SEQIDNo.:3中第228位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V228A);(5)SEQIDNo.:3中第54位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V54A);(6)SEQIDNo.:3中第53位氨基酸从苏氨酸到丙氨酸的突变(T53A);(7)SEQIDNo.:3中第152位氨基酸从亮氨酸到谷氨酰胺的突变(L152Q);(8)SEQIDNo.:3中第165位氨基酸从天冬氨酸到谷氨酸的突变,以及第266位氨基酸从苯丙氨酸到亮氨酸的突变(D165E;F266L);(9)SEQIDNo.:3中第53位氨基酸苏氨酸到丙氨酸的突变,以及第272位氨基酸从缬氨酸到异亮氨酸的突变(T53A;V272I);(10)SEQIDNo.:3中第5位氨基酸苏氨酸到丝氨酸的突变,以及第171位氨基酸从亮氨酸到谷氨酰胺的突变...

【专利技术属性】
技术研发人员:张翀李梅邢新会
申请(专利权)人:清华大学
类型:发明
国别省市:北京,11

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