一种耐受低pH值的运动发酵单胞菌突变株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种耐受低pH值的运动发酵单胞菌突变株及其应用，该菌株分类学命名为PH1‑29，保藏号为GDMCC 60260；该菌株经常温等离子体诱变后，在低pH的培养基上反复筛选得到。该菌株不仅可以确保低pH环境下正常生长，保证良好的发酵效率，而且由于低pH环境可以消除污染，也可以免去发酵过程的高温高压灭菌，控制生产成本，提高发酵效率。

【技术实现步骤摘要】
一种耐受低pH值的运动发酵单胞菌突变株及其应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种耐受低pH值的运动发酵单胞菌突变株及其应用，可应用于任何未高压灭菌的开放发酵环境中生产燃料乙醇生物基产品的用途。
技术介绍
在现代生物发酵产业中，高温灭菌是一个重要而关节的环节，事关发酵成本和产品安全性，因此值得重视。大多数微生物在低pH环境下都不能良好生长，因此降低pH是降低杂菌污染风险的策略。然而大多数发酵用菌株自身的pH耐受性也不高。如果利用突变手段筛选耐受低pH环境的发酵菌株，不仅可以确保发酵效率，而且由于低pH环境可以消除污染，也可以免去发酵过程的高温高压灭菌，也是控制生产成本的方法之一。运动发酵单胞菌(Zymomonasmobislis)是产乙醇的优良物种，近年来在可再生燃料乙醇研究和生产中受到广泛关注。然而目前在运动发酵单胞菌可以在pH＝4的环境下生长，但其生长性能较差，无法正常用于发酵产业。因此对于乙醇燃料发酵体系，低pH环境对于发酵菌株的生长仍然是一个巨大的挑战。因此本专利创建了一株突变菌株，可以在pH＝4和pH＝3.5的低pH环境中正常发酵产乙醇，该过程无需高温高压灭菌，而目前在该物种中尚无其它报道达到该水平。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术在于提出一种耐受低pH值的运动发酵单胞菌突变株及其应用。本专利技术提供了一种耐受低pH值的运动发酵单胞菌突变株，菌株分类学命名为运动发酵单胞菌PH1-29，保藏号为：GDMCC60260，于2017年10月25日保藏在广东省微生物菌种保藏中心。为了达到上述的目的，本专利技术所采用的技术方案是：1)通过常温等离子体诱变育种技术对运动发酵单胞菌菌体进行辐照诱变，首先将出发菌株ZM4进行活化培养，培养温度为30℃，培养时间为16h；2)取过夜培养物(106～108个细胞)，4℃下离心5～10min，转速为3000rpm，用生理盐水洗菌体并重悬于1mL生理盐水中；取10μL重悬细胞置于ARTP诱变育种仪诱变15～120s；3)辐照诱变后的细胞重悬恢复培养16h，再涂布在pH＝3.5或4的固体培养基上培养；4)挑选所有菌落在pH＝3.5的培养基上进行筛选，重复至少三次。具体的，步骤2)中等离子载气纯度为99.999％，气体流量为10～20标准气流量，电压100～120V，等离子体辐照温度22℃；具体的，步骤2)和步骤3)中采用的固体培养基包含：50g/L葡萄糖，2g/L磷酸二氢钾，10g/L酵母提取物，利用硫酸溶液调节培养基pH为3.5-4.0。本专利技术还提供了如上所述的运动发酵单胞菌突变株在未进行高压灭菌的开放发酵环境中用以生产燃料乙醇产品的用途。为了达到以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：(1)配制发酵培养基；(2)向所述的发酵培养基上接种运动发酵单胞菌PH1-29，进行发酵培养；(3)分离发酵体系中的乙醇。具体的，发酵生产乙醇的发酵过程的全部或者部分在pH＝3.5-4.0的发酵环境下进行。具体的，培养基的配方包括：50g/L葡萄糖，2g/L磷酸二氢钾，10g/L酵母提取物，利用硫酸溶液调节培养基的pH为3.5-4.0；具体的，接种发酵菌株的接种量为10％，发酵时间为20～90h。值得注意的是，在低pH值发酵体系下，普通菌株已经不能正常生长，但是突变菌株可以正常生长，因此在发酵过程中降低体系的pH值既可以保证突变菌株PH1-29的正常生长及高效生长乙醇，同时也可以抑制其他细菌的生长，从而可以减少常规发酵过程中的高压高温灭菌环节，降低乙醇发酵生产成本，提高发酵效率。本专利技术的有益效果是：本专利技术得到的突变菌株可以在未高压灭菌的低pH值环境下良好生长，在pH为3.5或4时，突变株的乙醇转化率远高于出发菌株；在使用过程中可减少发酵过程中高压灭菌环节，降低乙醇发酵生产成本，提高发酵效率。生物材料保藏本专利技术的耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌由保藏编号为CICC41465的运动发酵单胞菌经等离子体诱变和筛选得到。该菌株分类命名为运动发酵单胞菌(Zymomnasmobilis)PH1-29，保藏号为：GDMCC60260，保藏日期为2017年10月25日。保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号微生物所实验楼三楼。具体实施方式下面列举实施例对本专利技术进行进一步说明，但并不因此限制本专利技术的内容。实施例中的出发菌株为运动发酵单胞菌ZM4菌株，购自中国工业微生物菌种保藏中心，现编号为CICC41465。实施例1突变菌株PH1-29的筛选1)通过常温等离子体诱变育种技术对运动发酵单胞菌菌体进行辐照诱变，首先将出发菌株ZM4进行活化培养，培养温度为30℃，活化培养时间为16h；2)然后取过夜培养物(106-108个细胞)，4℃下离心10min，转速为3000rpm，用生理盐水洗菌体并重悬于1mL生理盐水中；取10μL重悬细胞置于ARTP诱变育种仪诱变15-120s；3)配制固体培养基：50g/L葡萄糖，2g/L磷酸二氢钾，10g/L酵母提取物，利用硫酸溶液调节培养基pH；4)将辐照诱变后的细胞重悬恢复培养16h，再涂布在pH＝4的固体培养基上培养；5)挑选所有菌落在pH＝3.5的培养基上进行筛选，重复三次筛选，得到突变菌株PH1-29。实施例2普通发酵培养基制备乙醇1)发酵培养基的配制：50g/L葡萄糖，2g/L磷酸二氢钾，10g/L酵母提取物，利用硫酸溶液调节培养基pH＝4；2)将突变菌株PH1-29和出发菌株ZM4分别接种于制备好培养基上，接种量为10％，进行发酵培养40h；3)分离乙醇，测定转化率。实施例3普通发酵培养基制备乙醇1)发酵培养基的配制：50g/L葡萄糖，2g/L磷酸二氢钾，10g/L酵母提取物，利用硫酸溶液调节培养基pH＝3.52)将突变菌株PH1-29和出发菌株ZM4分别接种于制备好培养基上，接种量为10％，进行发酵培养90h；3)分离乙醇，测定转化率。对比例正常pH下普通发酵培养基制备乙醇1)发酵培养基的配制：50g/L葡萄糖，2g/L磷酸二氢钾，10g/L酵母提取物，利用硫酸溶液调节培养基pH＝6.6，培养基经115℃灭菌20min；2)将突变菌株PH1-29和出发菌株ZM4分别接种于制备好培养基上，接种量为10％，进行发酵培养32h；3)分离乙醇，测定转化率。对筛选出的突变菌株PH1-29的发酵能力与出发菌株ZM4进行对比测试，调节培养基pH值，将两种菌株分别接种于培养基上进行发酵培养，对应发酵时间及转化率如表1所示：表1突变菌株与出发菌株在不同pH值下发酵能力对比注：培养基中pH值均用硫酸溶液调节所得，pH＝4和pH＝3.5条件下培养基未灭菌，pH＝6.6正常条件下，培养基经115℃灭菌20分钟。如表1所示，在正常中性pH(pH＝6.6)条件下，将突变株PH1-29和出发菌株ZM4接种于培养基上进行发酵培养，结果发现突变株24小时后可将50g/L葡萄糖全部消耗完，其乙醇转化率达到理论转化率的98％，而同等条件下出发菌株ZM4发酵32小时后的乙醇才达到乙醇转化率的90％。说明突变株在正常发酵条件下的性能也有一定提高。在不灭菌的环境下，用硫酸调节培养基的pH至4.0，该环境下有效消除杂菌污染。将突变株PH1-29和出发菌株ZM4接种于培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐受低pH值的运动发酵单胞菌突变株，其特征在于，菌株分类学命名为运动发酵单胞菌PH1‑29，保藏号为：GDMCC 60260。

【技术特征摘要】
1.一种耐受低pH值的运动发酵单胞菌突变株，其特征在于，菌株分类学命名为运动发酵单胞菌PH1-29，保藏号为：GDMCC60260。2.如权利要求1所述的一种耐受低pH值的运动发酵单胞菌突变株在未进行高压灭菌的开放发酵环境中用以生产燃料乙醇产品的用途。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的单胞菌发酵生产乙醇的发酵过程的全部或者部分在pH＝3.5～4的环境中进行。4.一种利用权利要求1中所述的运动发酵单胞菌PH1-29生产乙醇的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)配制发酵培养基；(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦晗，吴波，何明雄，
申请(专利权)人：农业部沼气科学研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51