一种磷酸肽固相萃取小柱及制备和应用制造技术

技术编号:18321570 阅读:38 留言:0更新日期:2018-07-01 00:03
本发明专利技术涉及一种基于离心辅助的磷酸肽固相萃取小柱的制备方法。通过离心辅助的方法,将合成的固定钛离子亲和色谱填料填入靠近吸液口处带有筛板的移液器吸头中制备成磷酸肽固相萃取小柱,并将小柱用于蛋白质组样品酶解液中磷酸肽的富集。该磷酸肽固相萃取小柱制备方法简单,成本低,容易操作,对磷酸肽的富集特异性高。

【技术实现步骤摘要】
一种磷酸肽固相萃取小柱及制备和应用
本专利技术属于蛋白质组学研究方向复杂生物样品预处理方法
,具体涉及磷酸肽固相萃取小柱的制备方法及其应用。
技术介绍
蛋白质磷酸化修饰是指由蛋白质激酶催化的,把ATP上的磷酸基转移到蛋白质氨基酸残基上的过程,是生物体内重要的共价修饰方式之一,也是目前研究的最为透彻的一种翻译后修饰。蛋白质的磷酸化与去磷酸化这一可逆过程调节着包括细胞的增殖、细胞分化、信号传导,细胞动态平衡等生命活动(文献1.Yi,T.;Zhai,B.etal.Quantitativephosphoproteomicanalysisrevealssystem-widesignalingpathwaysdownstreamofSDF-1/CXCR4inbreastcancerstemcells,PNAS,111,E2182-2190(2014).文献2.Humphrey,S.;Azimifar,S.etal.High-throughputphosphoproteomicsrevealsinvivoinsulin445signalingdynamics,Nat.Biotechnol.33,990-995(2015).)。同时,异常的磷酸化调节会导致许多严重的疾病,如癌症、糖尿病、心脏病和老年痴呆症等(文献3.Blume-Jensen,P.;Hunter,T.Oncogenickinasesignalling,Nature,411,355-365(2001).)。鉴于蛋白质的磷酸化在细胞活动中起着至关重要的作用,探索蛋白质磷酸化修饰过程的奥秘及其对蛋白质功能的影响已经成为众多生物化学家及蛋白质组学家所关心的内容。由于磷酸化蛋白质在生物体内的含量很低,磷酸肽在质谱中的磷酸化效率较低,当有大量非磷酸肽共存时更难被质谱检测到。为了提高磷酸化蛋白质组学分析的灵敏度,在对蛋白质酶解得到的复杂多肽混合物进行质谱分析前,首先要对其中的磷酸肽进行高通量、高选择性的富集。固定钛离子亲和色谱法是目前应用最为广泛的磷酸肽富集技术。传统的固定钛离子亲和色谱材料是单分散的,材料粒径是12微米左右,一般是将材料分散在溶液中对磷酸肽进行富集,但是这种富集方法需要反复的孵育和离心步骤,耗时长并且不适用于分析微量的样品(文献4.Zhou,H.;Ye,M.etal.Robustphosphoproteomeenrichmentusingmonodispersemicrosphere–basedimmobilizedtitanium(IV)ionaffinitychromatography.Nat.Protoc.8,461-480(2013).)。鉴于此,本专利技术主要是通过合成一种大粒径的固定钛离子亲和色谱材料作为固相萃取基质来制备用于磷酸肽富集的小柱,这种富集方式容易操作,耗时短,易于实现对蛋白质组样品酶解液中磷酸肽的高选择性的富集。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以简便、高效、高特异性的富集复杂蛋白样品蛋白酶解液中磷酸肽的固相萃取小柱的方法。本专利技术提供的方法是将大粒径的固定钛离子亲和色谱材料填入移液器吸头中制备成磷酸肽固相萃取小柱。通过离心辅助的固相萃取方法可以将磷酸肽从复杂样品蛋白酶解液中富集分离出来,然后通过质谱分析得到磷酸肽的鉴定结果。本专利技术采用如下技术方案:将固定钛离子亲和色谱填料装填入靠近吸液口处带有筛板的移液器吸头中构成磷酸肽固相萃取小柱。所述固定钛离子亲和色谱填料粒径为10-200μm;用于作为固相萃取柱管的移液器吸头体积是10μL-1mL,填料装填高度是0.1-2cm;筛板的材质为多聚四氟乙烯,直径为0.05-10cm,厚度0.1-0.5cm,孔径5-20μm,孔隙率5-30%。所述移液器吸头为GELoader枪头。所述固定钛离子亲和色谱填料的制备方法如下:(1)将0.1-10g聚乙烯醇分散到10-500mL去离子水中得到分散介质;(2)将1-100mL甲苯,1-100mL乙二醇二甲基丙烯酸酯,1-100mL甲基丙烯酸缩水甘油酯和0.1-10g过氧化苯甲酰混合得到单体相;(3)将步骤(2)的单体相加入步骤(1)的分散介质中在10-200℃下加热并搅拌2-24h得到高分子微球;(4)将步骤(3)得到的高分子微球与10-300mL乙二胺反应得到表面带有氨基的高分子微球;(5)将步骤(4)得到的表面带有氨基的高分子微球与1-20mL磷酸反应,随后再与10-300mM硫酸钛在4-37℃下反应2-24h制备得到固定钛离子亲和色谱填料。所述磷酸肽固相萃取小柱的制备方法,其特征在于:(1)将直径为0.1-10mm的筛板填入移液器吸头中,筛板距离吸液口的距离为0.5-1cm;(2)将枪头卡在直径为0.5-1.5cm套管中放入1.5mL离心管中;(3)将固定钛离子亲和色谱填料填入枪头中,在10-1000g的离心力作用下压实得到用于磷酸肽固相萃取的小柱。利用该小柱对蛋白质组样品酶解液中磷酸肽的富集是采用固相萃取的形式,操作简便,耗时短,并且容易实现磷酸肽与其它非特异性肽段的分离,从而实现磷酸肽的高特异性富集。本专利技术的优点:该富集小柱制备方法简单,将其用于蛋白质组样品酶解液中磷酸肽的富集时易于操作,特异性高,是一种简单而高效的磷酸肽富集方法。本专利技术是首次将大粒径的固定钛离子亲和色谱填料填入小柱中,并通过离心辅助的固相萃取方式来对蛋白质组样品酶解液中磷酸肽的富集,结合高分辨率的质谱分析,降低了样品的其它非磷酸肽的干扰复杂度,有利于磷酸化蛋白质组的分析。附图说明图1为所述用于磷酸肽富集的小柱示意图。图中为离心管1,移液器吸头2,套管3,固定钛离子亲和色谱填料4,圆形筛板5;图2为所述磷酸肽固相萃取小柱用于牛血清蛋白和β-酪蛋白所组成的蛋白质组样品酶解液中磷酸肽富集的结果。(A)牛血清蛋白和β-酪蛋白摩尔比为10:1时富集前的MALDI图,(B)牛血清蛋白和β-酪蛋白摩尔比为10:1时富集后的MALDI图,(C)牛血清蛋白和β-酪蛋白摩尔比为100:1时富集后的MALDI图,(D)牛血清蛋白和β-酪蛋白摩尔比为100:1时富集后的MALDI图。图3为所述磷酸肽固相萃取小柱用于HeLa细胞酶解液中磷酸肽富集的结果。填有1.25mg,2.5mg,5mg,12.5mg固定钛离子亲和色谱材料的小柱用于250μgHeLa细胞酶解液中磷酸肽的富集。对照组是用常规的单分散固定钛离子亲和色谱材料在溶液中对250μgHeLa细胞酶解液中磷酸肽的富集,其它操作都和用小柱富集相同。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术,但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。实施例1磷酸肽固相萃取小柱用于牛血清白蛋白和β-酪蛋白混合物的酶解液中的磷酸肽的富集:(1)将1g聚乙烯醇分散到120mL去离子水中得到分散介质;(2)将18mL甲苯,18mL乙二醇二甲基丙烯酸酯,20mL甲基丙烯酸缩水甘油酯和0.12g过氧化苯甲酰混合得到单体相;(3)将步骤(2)的单体相加入步骤(1)的分散介质中在70℃下加热并搅拌12h得到高分子微球;(4)将步骤(3)得到的高分子微球与150mL乙二胺反应得到表面带有氨基的高分子微球;(5)将步骤(4)得到的表面带有氨基的高分子微本文档来自技高网
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一种磷酸肽固相萃取小柱及制备和应用

【技术保护点】
1.一种磷酸肽固相萃取小柱,其特征在于:将固定钛离子亲和色谱填料装填入靠近吸液口处带有筛板的移液器吸头中构成磷酸肽固相萃取小柱。

【技术特征摘要】
1.一种磷酸肽固相萃取小柱,其特征在于:将固定钛离子亲和色谱填料装填入靠近吸液口处带有筛板的移液器吸头中构成磷酸肽固相萃取小柱。2.根据权利要求1所述的磷酸肽固相萃取小柱,其特征在于:所述固定钛离子亲和色谱填料粒径为10-200μm;用于作为固相萃取柱管的移液器吸头体积是10μL-1mL,填料装填高度是0.1-2cm;筛板的材质为多聚四氟乙烯,直径为0.05-10cm,厚度0.1-0.5cm,孔径5-20μm,孔隙率5-30%。3.根据权利要求1所述的磷酸肽固相萃取小柱,其特征在于:所述移液器吸头为GELoader吸头。4.根据权利要求1或2所述磷酸肽固相萃取小柱,其特征在于,固定钛离子亲和色谱填料的制备方法如下:(1)将0.1-10g聚乙烯醇分散到10-500mL去离子水中得到分散介质;(2)将1-100mL甲苯,1-100mL乙二醇二甲基丙烯酸酯,1-100mL甲基丙烯酸缩水甘油酯和0.1-10g过氧化苯甲酰混合得到单体相;(3)将步骤(2)的单体相加入步骤(1)的分散介质中在10-200℃下加热并搅拌2-24h得到高分子微球;(4)将步骤(3)得到的高分子微球与10-300mL乙二胺反应得到表面带有氨基的高分子微球;(5)将步骤(4)得到的表面带有氨基的高分子微球与1-20mL磷酸反应,随...

【专利技术属性】
技术研发人员:叶明亮姚亚婷董靖
申请(专利权)人:中国科学院大连化学物理研究所
类型:发明
国别省市:辽宁,21

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