脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法及其装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，将包含有目的基因的农杆菌置于电场中后，带负电荷的农杆菌在电场强度下由负极向正极泳动，从而进入植物体内的各个组织器官中。由于细胞壁是以纤维丝为基质组成的，含有许多小孔，在电场作用下农杆菌迁移过程中可通过细胞壁的小孔，并进一步通过细胞膜而进入植物细胞。本发明专利技术所采用的方法，极大地提高了基因转化效率，并且缩短了实验周期，特别是对于那些没有建立起再生体系的植物，具有一定的应用价值。

Pulsed electrophoretic assisted Agrobacterium mediated plant transgene method and device

The invention discloses a method of pulsed electrophoretic assisted Agrobacterium mediated plant transgene, which includes the Agrobacterium containing the target gene in the electric field, and the negatively charged Agrobacterium is swimming in the negative pole to the positive pole under the intensity of the electric field, thus entering the tissues and organs of the plant. As the cell wall is made of fibrous silk, it contains many small pores. In the process of Agrobacterium transfer under the action of electric field, the cell wall can pass through the small pores of the cell wall and further pass through the cell membrane to enter the plant cells. The method adopted in the present invention greatly improves the efficiency of gene transformation and reduces the experimental period, especially for plants that have not established the regeneration system.

【技术实现步骤摘要】
脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法及其装置
本专利技术涉及生物工程领域的植物转基因
，特别是涉及脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法。
技术介绍
转基因技术作为生物技术的核心在植物改良、医药、畜牧业和食品工业方面都具有巨大的发展潜力。申请公布号为CN104017825A，名称为离心沉降辅助植物转基因的方法，公布了将植物受体材料与农杆菌混合后在合理的转速下进行离心沉降处理，得到基因转换液，并且将感染过的植物受体材料在选择压力下进行筛选，最终获得阳性转化子。离心沉降不仅可以增加受体材料的创伤面积，而且使农杆菌在离心力作用下深入到受体材料内部，显著提高了植物转基因效率。然而以农杆菌转化为主的植物转基因技术目前存在转化效率低下的问题，大部分植物的植株再生体系没有建立起来，导致平均转化率仅为1%左右，这个问题也成为了限制转基因植物产业化的主要因素。利用传统的农杆菌介导转化时，被农杆菌侵染的外植物细胞主要分面在植物组织的表面，而大量的内部细胞缺乏与农杆菌接触的机会。研究表明，农杆菌带负电，将包含有目的基因的农杆菌置于电场中后，带负电荷的农杆菌在电场强度下由负极向正极泳动，从而进入植物体内的各个组织器官中。由于细胞壁是以纤维丝为基质组成的，含有许多小孔，在电场作用下农杆菌迁移过程中可通过细胞壁的小孔，并进一步通过细胞膜而进入植物细胞。目前已有水稻玉米等植物的脉冲电泳转基因报道，但这些报道中将DNA直接导入种子或离体组织、细胞，并没有整合到受体植物的基因组中。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法,本专利技术以植物植株为受体，并将含有目的基因的农杆菌导入植物内部，极大地提高了基因转化效率，并且缩短了实验周期，具有一定的应用价值。本专利技术所采用的技术方案是：一种脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，包括如下步骤：步骤一、收集长势良好、根系完整的受体植物苗备用；步骤二、将包含有目的基因的农杆菌溶液在摇床上震荡培养，使其OD值达到0.4-0.8；步骤三、步骤二得到的农杆菌溶液在3300-3800转/分钟的条件下离心1-3分钟，然后用pH为5-5.4的MS0液体培养基重悬，最后往悬浮液中加入100-200μM的乙酰丁香酮，得到转化溶液；步骤四、把步骤一中准备好的带根的受体植物苗插到步骤三中得到的转化溶液中；步骤五、接通电源开始电泳，电泳持续2-4小时；步骤六、步骤五完成后将受体植物转入MS0固体培养基中，25℃下暗培养2-3天,MS0培养基为不添加植物激素的MS培养基；步骤七、暗培养后的植株转入添加固体基质的花盆中，并于人气候室中诱导开花结实；步骤八、从步骤其中得到的植株种子中筛选纯合的阳性转化子，便可得到转基因植物种子。进一步地，受体植物在步骤五中进行电泳时，负极插入受体植物近根端的微管组织中，正极可分流出若干支路，分别插入受体植物上端的茎、叶脉和生长点组织中。进一步地，步骤五中所述受体植物进行电泳时，其电压为100-150毫伏。进一步地，步骤五中所述受体植物为完整的植株，大田种植苗、温室苗或试管苗均可。一种脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因装置，连接在转基因植株受体的根须部和茎叶部的两端；转基因植株受体置于包含有培养溶液的容器中；转基因植株受体的根须顶部全部淹没在培养溶液内；辅助农杆菌介导的植物转基因装置包括微电泳仪和连接在其一端的直径为0.8-1.5毫米的金属管，金属管中设为若干孔，为目的基因进入植物的通道，其插入植株受体的近根部位的维管中，并且其浸泡于培养溶液内；微电泳仪包括正极和负极，其正极通过一根总导线和若干根分流导线组成的正极导线连接在植株受体的叶、茎和生长点上，其负极通过负极导线穿过金属管连接在培养溶液内根须部中间。本专利技术的辅助农杆菌介导的植物转基因装置，在现有的微电泳仪的基础上，将其正极连接在转基因植株受体的茎、叶等若干个生长点，将其负极通过负极导线连接在转基因受体植株的根须部一侧的培养溶液内，并且位于培养溶液位置处的负极导线外还套有金属管，金属管中设有孔道为目的基因进入植物部提供通道。进一步地，微电泳仪的电压为100-150毫伏，连接在其两端的负极导线和正极导线为铂丝或者银丝，保证转基因植株受体具有较高的转换率以及转换效率。进一步地，茎叶部包括茎部和叶面，正极导线分别与茎部和叶面连接的若干根分流导线直接插入其对应的茎部或叶面，并且与茎部连接的分流导线数量不少于两根，与叶面连接的分流导线的数量也不少于两根，使得其具有更高的转换率。进一步地，正极导线的分流导线的数量与受体植物的茎部或叶面等生长点的数量保持一致，也就是说正极导线尽可能多分出一些来，确保转基因植物整体被覆盖到电场下，无死角，减小嵌合体出现的概率。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：一种脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法。将包含有目的基因的农杆菌置于电场中后，带负电荷的农杆菌在电场强度下由负极向正极泳动，从而进入植物体内的各个组织器官中。由于细胞壁是以纤维丝为基质组成的，含有许多小孔，在电场作用下农杆菌迁移过程中可通过细胞壁的小孔，并进一步通过细胞膜而进入植物细胞。本专利技术所采用的方法，极大地提高了基因转化效率，并且缩短了实验周期，特别是对于那些没有建立起再生体系的植物，具有一定的应用价值。附图说明图1为一种脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法的一个实施例的步骤五电泳时受体植物与电源的连接结构示意图；其中：1-容器，2-转基因植株受体，21-根须部，22-茎叶部，23-茎部，24-叶面；3-微电泳仪，31-正极，32-负极，4-金属管，41-孔，5-负极导线，6-正极导线，61-总导线，62-分流导线；7-培养溶液。具体实施方式为了加深对本专利技术的理解，下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明，该实施例仅用于解释本专利技术，并不对本专利技术的保护范围构成限定。实施例一，以小蔓长春花植株为受体植株，转换外源基因为来自烟草的几丁质酶基因本实施例对小蔓长春花植株进行了脉冲电泳辅助转基因试验，被转化的外源基因为来自烟草的几丁质酶基因。本实施例使用的小蔓长春花苗来自本实验室。本实施例包括如下步骤：步骤一、从大田中采挖20棵健壮的小蔓长春花苗作为受体；步骤二、将包含有几丁质酶基因的农杆菌溶液在摇床上震荡培养，使OD值达到0.6；步骤三、步骤二得到农杆菌溶液在3500转/分钟的条件下离心2分钟，然后用pH为5.2的MS0液体培养基重悬，最后往悬浮液中加入200μM的乙酰丁香酮，得到转化溶液；步骤四、把带根的受体植物苗插到转化溶液中；步骤五、接通电源开始电泳；步骤六、2小时后，将受体植物转入MS0固体培养基中，25℃下暗培养2天；步骤七、暗培养后的植株转入添加固体基质的花盆中，并于人气候室中诱导开花结实；步骤八、从种子中筛选纯合的阳性转化子。本实施例对20棵小蔓长春花植株进行了遗传转化，结果11棵苗中检测到了几丁质酶基因的存在，PCR和核酸杂交检测的结果相吻合，并得到了纯合的阳性种子。从初步的研究结果来看，整体转化效率比较高。实施例二，以蒙古韭为受体植株，转换外源基因为来自烟草的几丁质酶基因本实施例对蒙古韭植株进行了脉冲电泳辅助转基因试验，被转化的外源基因为来自烟草的几丁质酶基因。本实施例使用的蒙古本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一、收集长势良好、根系完整的受体植物苗备用；步骤二、将包含有目的基因的农杆菌溶液在摇床上震荡培养，使其OD值达到0.4‑0.8；步骤三、步骤二得到的农杆菌溶液在3300‑3800转/分钟的条件下离心1‑3分钟，然后用pH为5‑5.4的MS0液体培养基重悬，最后往悬浮液中加入100‑200μM的乙酰丁香酮，得到转化溶液；步骤四、把步骤一中准备好的带根的受体植物苗插到步骤三中得到的转化溶液中；步骤五、接通电源，当电压为100‑150毫伏开始电泳，受体植物在进行电泳时，负极插入受体植物近根端的微管组织中，正极可分流出若干支路，分别插入受体植物上端的茎、叶脉和生长点组织中，电泳持续2‑4小时；步骤六、步骤五完成后将受体植物转入MS0固体培养基中，23‑27℃下暗培养2‑3天,所述MS0培养基为不添加植物激素的MS培养基；步骤七、暗培养后的植株转入添加固体基质的花盆中，并于人工气候室中诱导开花结实；步骤八、从步骤七中得到的植株种子中筛选纯合的阳性转化子，便可得到转基因植物种子。

【技术特征摘要】
1.脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一、收集长势良好、根系完整的受体植物苗备用；步骤二、将包含有目的基因的农杆菌溶液在摇床上震荡培养，使其OD值达到0.4-0.8；步骤三、步骤二得到的农杆菌溶液在3300-3800转/分钟的条件下离心1-3分钟，然后用pH为5-5.4的MS0液体培养基重悬，最后往悬浮液中加入100-200μM的乙酰丁香酮，得到转化溶液；步骤四、把步骤一中准备好的带根的受体植物苗插到步骤三中得到的转化溶液中；步骤五、接通电源，当电压为100-150毫伏开始电泳，受体植物在进行电泳时，负极插入受体植物近根端的微管组织中，正极可分流出若干支路，分别插入受体植物上端的茎、叶脉和生长点组织中，电泳持续2-4小时；步骤六、步骤五完成后将受体植物转入MS0固体培养基中，23-27℃下暗培养2-3天,所述MS0培养基为不添加植物激素的MS培养基；步骤七、暗培养后的植株转入添加固体基质的花盆中，并于人工气候室中诱导开花结实；步骤八、从步骤七中得到的植株种子中筛选纯合的阳性转化子，便可得到转基因植物种子。2.根据权利要求1所述的脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，其特征在于：所述受体植物为完整的植株。3.根据权利要求2所述的脉冲电泳辅助农杆菌介导的植物转基因方法，其特征在于：大田种植苗、温室苗或试管苗均可。4.根据权利要求1的植物转基因方法辅助农杆菌介导的植物转基因装置，其特征在于：连接在转基因植株受体（2）的根须部（21）和茎叶部（23）...

【专利技术属性】
技术研发人员：张边江，陈全战，唐宁，
申请(专利权)人：南京晓庄学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32