一种检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，包括抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、发光底物液；抗试剂A是碱性磷酸酶标记的尿微量白蛋白衍生物；抗试剂B是FITC标记的尿微量白蛋白多克隆抗体，磁微粒试剂是包被有FITC抗体的羧基磁微粒混，同时还公开了该试剂盒的制备方法。该试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，并且采用了一步法反应模式，使得检测性能大大提高(灵敏度、精密性、检测范围等)，反应时间大大缩短，从开始加样到检测结果，时间少于35min,明显快于同类试剂盒)；偶联效率高，结合牢固，且工艺稳定，在提高产品性能的同时，大大降低了产品成本。

【技术实现步骤摘要】
一种检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及生物化学
，具体涉及一种采用免疫竞争法、磁微粒化学发光法测定人体中尿微量白蛋白(ALB)含量的试剂盒。
技术介绍
微量白蛋白尿是指在尿中出现微量白蛋白。白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，但在生理条件下尿液中仅出现极少量白蛋白。微量白蛋白尿反映肾脏异常渗漏蛋白质。当一名患者有高血压或糖尿病或同时患有这两种疾病(经常同时发生)时，肾脏血管会发生病变改变了肾脏滤过蛋白质(尤其是白蛋白)的功能，这使得蛋白质渗漏到尿中。微量白蛋白尿是糖尿病影响肾脏受损的早期征象，为糖尿病肾病。人体代谢正常情况下，尿中的白蛋白极少，如果在体检后发现尿中的微量白蛋白在20mg/L-200mg/L范围内，就属于微量白蛋白尿，如果患者能够经过规范的修复肾单位，逆转纤维化治疗，尚可彻底修复肾小球，消除蛋白尿，尿常规尿蛋白的显示为阴性。而当尿中微量白蛋白超过200mg/L时，肾病患者已有大量白蛋白漏出，可能出现低蛋白血症，肾病发展离不可逆期只有一步之遥，尿常规测试尿蛋白阳性，如果不及时进行医治，就会进入尿毒症期。目前已知的尿微量白蛋白测定方法有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶乳增强比浊法等。放射免疫法步骤繁琐，试剂价格昂贵，需使用配套的仪器且存在放射性污染。酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。胶乳增强免疫比浊法操作简单、快速，但是灵敏度低、低值重复性差。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有的尿微量白蛋白测定方法检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要的缺陷，提供一种检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：本专利技术的试剂盒包括抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、发光底物液和浓缩洗液；其中，所述抗试剂A是碱性磷酸酶标记的尿微量白蛋白衍生物，含BSA的抗试剂A缓冲液；所述碱性磷酸酶标记的尿微量白蛋白衍生物是通过偶联剂将尿微量白蛋白衍生物和碱性磷酸酶偶联后获得，浓度为0.2ug/mL；所述抗试剂A缓冲液为10～100mM的Tris-HCl溶液，pH值为7-8，含有浓度为2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化钠、0.05-0.1wt％的叠氮钠、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mMEDTA；所述抗试剂B是FITC标记的尿微量白蛋白多克隆抗，含BSA的抗试剂B缓冲液；所述FITC标记的尿微量白蛋白抗体是通过偶联剂将尿微量白蛋白抗体和FITC偶联后获得，浓度为1.0ug/mL；所述抗试剂B缓冲液为10～100mM的Tris-HCl溶液，pH值为7-8，0.12wt％的ANS、2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化钠、0.05-0.1wt％的叠氮钠、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mMEDTA；所述磁微粒试剂是包被有FITC抗体的羧基磁微粒混悬液；所述磁微粒试剂是包被有FITC抗体的磁微粒混悬液。根据使用量取羧基磁微粒，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在酸性条件下(PH4.5-PH5.5)进行活化，活化完成后，加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用PH7.6的0.01M的PBS缓冲液洗去多余化活化剂；加入适量的FITC多克隆抗体，使其浓度为0.5ul/mg磁微粒，在弱碱性条件下(PH7.4-PH7.8)震荡反应，反应结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1％牛血清白蛋白的0.01M的PBS缓冲液进行封闭，封闭结束后，加入封闭液以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为2mg/ml；该磁微粒混悬液置于2-8℃保存，以备使用；所述校准品和质控品由人源性尿微量白蛋白和缓冲液组成，缓冲液为浓度50-200mM的Tris-HCl溶液，含有浓度为0.1～1wt％的牛血清白蛋白、0.05～0.5wt％的PC-300、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠；所述尿微量白蛋白校准品包括人源性尿微量白蛋白浓度分别为0、1.5、6.0、25、100、400ug/ml的一组校准品。所述发光底物液是含有AMPPD的Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl溶液的pH值为8.0～10.0，含有浓度20V％的AMPPD、16wt％的NaCl、0.4wt％的KCl和2.42wt％的Tris；进一步的，所述偶联剂选自碳化二亚胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的一种或多种。进一步的，所述FITC抗体选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白和血蓝蛋白中的一种或多种。进一步的，所述羧基磁微粒为核壳结构，直径范围为100～4500nm，浓度为1～5mg/mL；所述羧基磁微粒的表面带有由羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基的一种或多种修饰的化学基团；所述FITC抗体通过羧基磁微粒携带的基团键合在羧基磁微粒表面。进一步的，所述浓缩洗涤液是含有吐温20的Tris-HCl溶液，pH值为7.4，含有浓度16wt％的NaCl、0.4wt％的KCl、2.42wt％的Tris，使用时用双蒸水15倍稀释。本专利技术的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：一、磁微粒试剂的制备：1)、将羧基磁微粒用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在pH4.5～pH5.5下进行活化，然后在磁场上静置使羧基磁微粒与液体分开，弃去上清；2)用pH7.6的0.01M的PBS缓冲液洗去多余化活化剂，然后加入适量的FITC抗体，使FITC抗体的浓度为0.5uL/mg，在pH7.4～pH7.8下震荡反应；3)反应结束后在磁场上静置使羧基磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1wt％牛血清白蛋白的0.01M的PBS缓冲液进行封闭；4)封闭结束后，加入封闭液以保存磁微粒试剂，使包被有FITC抗体的羧基磁微粒的最终浓度为2mg/mL；该磁微粒混悬液置于2-8℃保存，以备使用；二、抗试剂A的制备尿微量白蛋白衍生物的制备使用SMCC活化剂将尿微量白蛋白进行活化，生成马来酰亚胺-尿微量白蛋白衍生物；马来酰亚胺-尿微量白蛋白衍生物含有可以与-SH基团反应的马来酰亚胺基团，加入含有-SH的碱性磷酸酶，将ALB衍生物与碱性磷酸酶连接在一起；抗试剂A缓冲液的制备将9gNaCl、0.5g叠氮钠、3gPC-300、10g牛血清白蛋白和5.84gEDTA溶于900mL双蒸水中，用HCl调整PH7.0-8.0，用双蒸水定容至1000mL；三、抗试剂B的制备将1.2gANS、9gNaCl、0.5g叠氮钠、3gPC-300、10g牛血清白蛋白和5.84gEDTA溶于900mL双蒸水中，用HCl调整pH7.0～8.0，用双蒸水定容至1000mL，获得含BSA的缓冲液；在BSA缓冲液中，25℃条件下，FITC与尿微量白蛋白抗体产生偶联反应，经过蛋白纯化仪纯化，收集包被有FITC的尿微量白蛋白抗体，经过紫外分光光度计检测包被有FITC的尿微量白蛋白抗体的浓度，调整至工作浓度为1.4ug/mL；四、校准品和质控品的制备用含有终浓度0.1-1wt％的牛血清白蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括：抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、发光底物液；其中，所述抗试剂A是碱性磷酸酶标记的尿微量白蛋白衍生物，含BSA的抗试剂A缓冲液；所述碱性磷酸酶标记的尿微量白蛋白衍生物是通过偶联剂将尿微量白蛋白衍生物和碱性磷酸酶偶联后获得，浓度为0.2ug/mL；所述抗试剂A缓冲液为10～100mM的Tris‑HCl溶液，pH值为7‑8，含有浓度为2‑6wt％的PEG‑6000、0.7‑0.9wt％的氯化钠、0.05‑0.1wt％的叠氮钠、0.3wt％的PC‑300、0.1‑1wt％牛血清白蛋白以及20mM EDTA；所述抗试剂B是FITC标记的尿微量白蛋白多克隆抗，含BSA的抗试剂B缓冲液；所述FITC标记的尿微量白蛋白抗体是通过偶联剂将尿微量白蛋白抗体和FITC偶联后获得，浓度为1.0ug/mL；；所述抗试剂B缓冲液为10～100mM的Tris‑HCl溶液，pH值为7‑8，0.12wt％的ANS、2‑6wt％的PEG‑6000、0.7‑0.9wt％的氯化钠、0.05‑0.1wt％的叠氮钠、0.3wt％的PC‑300、0.1‑1wt％牛血清白蛋白以及20mM EDTA；所述磁微粒试剂是包被有FITC抗体的羧基磁微粒混悬液；羧基磁微粒用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺在pH4.5‑pH5.5下活化，加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用pH7.6的0.01M的PBS缓冲液洗去多余化活化剂；加入适量的FITC多克隆抗体，使其浓度为0.5uL/mg磁微粒，在pH7.4‑pH7.8下震荡反应，反应结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1％牛血清白蛋白的0.01M的PBS缓冲液进行封闭，封闭结束后，加入封闭液以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为2mg/ml；该磁微粒混悬液置于2‑8℃保存，以备使用；所述校准品和质控品由人源性尿微量白蛋白和缓冲液组成，缓冲液为浓度50‑200mM的Tris‑HCl溶液，含有浓度为0.1～1wt％的牛血清白蛋白、0.05～0.5wt％的PC‑300、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠；所述尿微量白蛋白校准品包括人源性尿微量白蛋白浓度分别为0、1.5、6.0、25、100、400ug/ml的一组校准品；所述发光底物液是含有AMPPD的Tris‑HCl溶液，所述Tris‑HCl溶液的pH值为8.0～10.0，含有浓度20V％的AMPPD、16wt％的NaCl、0.4wt％的KCl和2.42wt％的Tris。...

【技术特征摘要】
1.一种检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括：抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、发光底物液；其中，所述抗试剂A是碱性磷酸酶标记的尿微量白蛋白衍生物，含BSA的抗试剂A缓冲液；所述碱性磷酸酶标记的尿微量白蛋白衍生物是通过偶联剂将尿微量白蛋白衍生物和碱性磷酸酶偶联后获得，浓度为0.2ug/mL；所述抗试剂A缓冲液为10～100mM的Tris-HCl溶液，pH值为7-8，含有浓度为2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化钠、0.05-0.1wt％的叠氮钠、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mMEDTA；所述抗试剂B是FITC标记的尿微量白蛋白多克隆抗，含BSA的抗试剂B缓冲液；所述FITC标记的尿微量白蛋白抗体是通过偶联剂将尿微量白蛋白抗体和FITC偶联后获得，浓度为1.0ug/mL；；所述抗试剂B缓冲液为10～100mM的Tris-HCl溶液，pH值为7-8，0.12wt％的ANS、2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化钠、0.05-0.1wt％的叠氮钠、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mMEDTA；所述磁微粒试剂是包被有FITC抗体的羧基磁微粒混悬液；羧基磁微粒用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在pH4.5-pH5.5下活化，加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用pH7.6的0.01M的PBS缓冲液洗去多余化活化剂；加入适量的FITC多克隆抗体，使其浓度为0.5uL/mg磁微粒，在pH7.4-pH7.8下震荡反应，反应结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1％牛血清白蛋白的0.01M的PBS缓冲液进行封闭，封闭结束后，加入封闭液以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为2mg/ml；该磁微粒混悬液置于2-8℃保存，以备使用；所述校准品和质控品由人源性尿微量白蛋白和缓冲液组成，缓冲液为浓度50-200mM的Tris-HCl溶液，含有浓度为0.1～1wt％的牛血清白蛋白、0.05～0.5wt％的PC-300、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠；所述尿微量白蛋白校准品包括人源性尿微量白蛋白浓度分别为0、1.5、6.0、25、100、400ug/ml的一组校准品；所述发光底物液是含有AMPPD的Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl溶液的pH值为8.0～10.0，含有浓度20V％的AMPPD、16wt％的NaCl、0.4wt％的KCl和2.42wt％的Tris。2.根据权利要求1所述的检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述偶联剂选自碳化二亚胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的一种或多种。3.根据权利要求3所述的检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述FITC抗体选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白和血蓝蛋白中的中的一种亚型或多种亚型的混合。4.根据权利要求1所述的检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述羧基磁微粒为核壳结构，直径范围为100～4500nm，浓度为1～5mg/mL；所述羧基磁微粒的表面带有由羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基的一种或多种修饰的化学基团；所述FITC抗体通过羧基磁微粒携带的基团键合在羧基磁微粒表面。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振世，季连星，孔晓凯，王赟，石慧，赵飏，
申请(专利权)人：泰州泽成生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32