一种测定β-淀粉酶活力的方法技术

本发明专利技术公开了一种简单高效测定β‑淀粉酶活力的方法，属于淀粉酶领域。β‑淀粉酶活力的测定方法有DNS试剂显色法和对硝基苯酚麦芽戊糖苷法。DNS法耗时长、灵敏度低，其测定的β‑淀粉酶活力值会受到α‑淀粉酶的影响，而对硝基苯酚麦芽戊糖苷法简便快速，灵敏度高，但是只能表示β‑淀粉酶的相对酶活。因此，本发明专利技术通过将DNS试剂显色法和对硝基苯酚麦芽戊糖苷法进行线性拟合，结合两者的优势，建立了一种操作简单、灵敏度高的可测定β‑淀粉酶绝对酶活值的β‑淀粉酶活力测定方法。采用该方法可以简单快速地测定出无论是纯化β‑淀粉酶还是β‑淀粉酶酶制剂混合物中β‑淀粉酶的绝对酶活值，初步应用结果显示该优化方法结果也较为准确，可以进一步推广。

【技术实现步骤摘要】
一种简单高效测定β-淀粉酶活力的方法
本专利技术涉及一种简单高效测定β-淀粉酶活力的方法，属于淀粉酶领域。
技术介绍
β-淀粉酶，又称麦芽糖苷酶，是一种外切型糖化酶。它能从淀粉的非还原性末端开始依次切开间隔的α-1,4糖苷键，水解产物主要是麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶广泛应用于啤酒酿造、食品加工等行业，是一种重要的工业用酶。目前β-淀粉酶酶活的测定方法有DNS试剂显色法和对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法。DNS法主要是通过测定酶解产物中的还原糖含量来确定β-淀粉酶的活性，是使用最为广泛的β-淀粉酶酶活测定方法。然而，由于植物中提取的粗酶液和某些微生物表达的β-淀粉酶中可能混有其他的淀粉水解酶类(特别是α-淀粉酶)，在此情况下由还原糖含量表示的酶活值并不准确，因此准确测定粗酶液中β-淀粉酶的绝对酶活存在一定困难。且DNS法灵敏度低、耗时、试剂具有一定的毒性，因此比较适用于纯化后β-淀粉酶酶活的测定。对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法以β-淀粉酶的专一性底物对硝基苯酚麦芽戊糖苷作为底物，β-淀粉酶与其反应释放一分子麦芽糖和对硝基苯酚麦芽三糖从而确定酶活力，专一性较高，且方法快速、灵敏、操作简便，但是其酶活单位是以单位时间内释放的对硝基苯酚麦芽戊糖苷的量来计量的，通常用β-淀粉酶的相对酶活来表示，具有一定的局限性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是既操作简单，又能准确测定淀粉酶粗酶液β-淀粉酶的绝对酶活，为了解决上述问题，本实验将DNS测定法与对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法进行结合，旨在建立一种准确、简便的测定粗酶液中β-淀粉酶绝对酶活值的方法。本专利技术的目的是提供一种测定β-淀粉酶活力的方法，所述方法是联合采用对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法测定待测样品中β-淀粉酶活力。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法中待测样品中β-淀粉酶的浓度为12-60μg/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法中线性拟合曲线回归方程为y＝0.0079x+0.0089，R2值为0.9886。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体是：(1)采用纯化的β-淀粉酶稀释为不同浓度，分别采用对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法测定反应后的吸光值；(2)将对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法测定的吸光值进行相关性分析，确定线性浓度范围；(3)将纯化的β-淀粉酶稀释至步骤(2)的线性浓度范围内进行检测，建立线性拟合曲线回归方程y＝0.0079x+0.0089，R2值为0.9886；(4)将待测样品采用对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法进行测定，利用回归方程计算β-淀粉酶活力。在本专利技术的一种实施方式中，所述对硝基苯酚麦芽戊糖苷法具体为：取10～30μL酶液与专一性底物对硝基苯酚麦芽戊糖溶液一同置于50～60℃下保温2～4min后混合，50～60℃下反应10～15min，加入200～400μL终止缓冲液，取反应液测定400nm处的吸光值。在本专利技术的一种实施方式中，所述DNS法具体为：分别将1～2mL酶液和淀粉溶液置于50～60℃恒温水浴10～15min，再向酶液中加入1～2mL1～2％淀粉溶液，50～60℃恒温水浴中10～15min，置于冰水浴2～4min终止反应，然后加入2～4mLDNS试剂，混匀，沸水浴中煮沸10～15min，取出冷却，用水定容至25mL，在540nm处测定吸光值。本专利技术的第二个目的是提供所述的方法在啤酒酿造、食品加工中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术所建立的线性拟合曲线R2值为0.9886，相关程度较高，将其应用于商品化β-淀粉酶产品，其测定结果是：相对误差小于10％，且能确定该样品中基本不含有α-淀粉酶。相较于其他两种β-淀粉酶酶活的测定方法，该法结合了DNS法与对硝基苯酚麦芽戊糖苷法各自的优势同时克服各自的缺点。采用该方法可以简单快速地测定出无论是纯化β-淀粉酶还是β-淀粉酶酶制剂混合物中β-淀粉酶的绝对酶活值，初步应用结果显示该优化方法结果也较为准确，可以进一步推广。附图说明图1为大肠杆菌诱导表达β-淀粉酶纯化SDS-PAGE结果；M：蛋白质标准分子量；1：大肠杆菌细胞破壁上清液浓缩；图2为高浓度梯度下DNS方法测定结果线性关系；图3为线性浓度范围；(A)对硝基苯酚麦芽戊糖苷法线性范围；(B)DNS法线性范围；(C)DNS法线性范围(12-60μg/mL)；图4为线性拟合曲线。具体实施方式实施例1：DNS法与对硝基苯酚麦芽戊糖苷法测定步骤酶活定义为：1mL酶液在55℃、pH6.0条件下，10分钟水解1％(w/v)可溶性淀粉液生成1mg麦芽糖，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。DNS法：标准曲线的绘制：取6支25mL具塞比色管，分别加入0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml麦芽糖标准溶液，然后向各管中加入蒸馏水至2mL，再加入3mLDNS试剂，沸水浴加热10min，取出冷却至室温，加蒸馏水稀释至25mL。混匀后以未加麦芽糖标准溶液的比色管为对照在540nm下测量吸光度，以吸光度为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标，绘制标准曲线，得出其线性回归方程为y＝2979+0.0226(R2＝0.9935)。样品的测定：取若干25mL具塞比色管编号，分别加入1mL酶液(20mmol/L磷酸盐缓冲液稀释)，将各比色管和淀粉溶液置于55℃恒温水浴10min，再向各比色管中加入1mL1％淀粉溶液，55℃恒温水浴中10min，置于冰水浴2min终止反应，然后加入3mLDNS试剂，混匀，沸水浴中煮沸10min，取出冷却，用蒸馏水定容至25mL，以蒸馏水代替酶液为空白，在540nm处测定吸光度，计算酶活力。对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法：使用爱尔兰Megazyme公司Betamyl-3Method试剂盒测定酶活力，实验方法参考试剂盒说明书进行一定修改。取20μL酶液于2mLEP管，并与专一性底物对硝基苯酚麦芽戊糖溶液一同置于55℃下保温2min，55℃下反应10min，加入300μL终止缓冲液，取200μL反应液，以蒸馏水为对照测定400nm处的吸光度。实施例2：β-淀粉酶的纯化将一株能够表达大麦β-淀粉酶基因的重组大肠杆菌，经过诱导表达、菌体收集后，通过超声波破碎法破壁提取β-淀粉酶，离心浓缩后通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白质进行纯化。纯化结果如图1所示，纯化后β-淀粉酶在SDS-PAGE图谱中为单一条带，说明β-淀粉酶已经达到电泳纯，可以用于进一步分析。实施例2：线性浓度范围的确定对于相同浓度的β-淀粉酶，由于DNS法所测出的吸光度值一般偏高，而对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法所测出的吸光度值偏低，如表1所示，当酶液浓度梯度较高时，使用DNS法所测得的吸光度值结果会超过其置信区间(0.2-0.8)，且相关性较差(相关性结果见图2所示)。而当酶液浓度梯度较低时，使用对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法所测定的结果会低于其置信区间，同时标准曲线的应用范围较窄，所以调整合适的β-淀粉酶浓度梯度，使得用两种方法进行测定时，吸光度值的结果落在置信区间内，同时具有较宽的应用范围是建立该方法的关键。表1不同浓度的β-淀粉酶时DNS法和对硝基苯酚麦芽戊糖苷法测定值测定纯化后β-淀粉酶蛋白浓度为240μg/mL，将其按照4、8、12、16、20、24％的浓度梯度稀释，采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定β‑淀粉酶活力的方法，其特征在于，所述方法是联合采用对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法测定待测样品中β‑淀粉酶活力。

【技术特征摘要】
1.一种测定β-淀粉酶活力的方法，其特征在于，所述方法是联合采用对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法测定待测样品中β-淀粉酶活力。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中待测样品中β-淀粉酶的浓度为12-60μg/mL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中线性拟合曲线回归方程为y＝0.0079x+0.0089，R2值为0.9886。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)采用纯化的β-淀粉酶稀释为不同浓度，分别采用对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法测定反应后的吸光值；(2)将对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法测定的吸光值进行相关性分析，确定线性浓度范围；(3)将纯化的β-淀粉酶稀释至步骤(2)的线性浓度范围内进行检测，建立线性拟合曲线回归方程y＝0.0079x+0.0089，R2值为0.9886；(4)将待测样品采用对硝...

【专利技术属性】
技术研发人员：李崎，汪薛良，段鸿绪，刘春凤，钮成拓，李永仙，郑飞云，王金晶，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32