长链非编码RNA LINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了长链非编码RNA LINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用。可以检测长链非编码RNA LINC00336在肺鳞癌患者中的表达水平，为肺鳞癌患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

【技术实现步骤摘要】
长链非编码RNALINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNALINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测试剂中的应用。
技术介绍
肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，肺鳞癌即鳞状细胞癌，是一种最常见的肺癌类型，是来源于支气管上皮的一种恶性上皮性肿瘤，占原发性肺癌的40％～51％，经手术、放化疗等综合治疗后，其5年生存率仍低于15％。目前，对肺鳞癌患者的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对肺鳞癌患者进行预后判定的需求。因此，对肺鳞癌患者预后进行判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为胸外科领域亟待解决的重要课题。长链非编码RNA(longnoncodingRNA)是长度大于200nt的非编码RNA的统称。最初的研究认为它是转录组的"噪音"，但近十年来的生命科学研究发现，它们参与了多项生物调控过程。有研究表明，长链非编码RNA可作为人类基因组中一类非常重要的表观遗传调控因子，通过表观遗传、转录调控以及转录后调控等多种机制调控DNA甲基化、组蛋白修饰或染色质重构使基因沉默或激活。近年来，长链非编码RNA作为一类重要的调控分子及其在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应用价值，已经逐渐得到研究者的重视。有研究表明HOTAIR在原发乳腺肿瘤和转移瘤中的表达都会增加，原发肿瘤中HOTAIR的表达水平可以用来有效预测癌转移和死亡。长链非编码RNAPCA3在前列腺癌中高度过表达，这种长链非编码RNA是在尿液中发现的，相当便于临床检测。长链非编码RNALALR1通过激活Wnt/β-catenin信号，加速了细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。采用药物靶干预长链非编码RNALALR1诱导肝脏再生，有可能有益于肝衰竭和肝移植治疗。由此可见，长链非编码RNA作为诊断、预后和治疗的分子标志物具有巨大潜力。目前，对肺鳞癌患者的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对肺鳞癌患者进行预后判定的需求。因此，对肺鳞癌患者预后进行判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为胸外科领域亟待解决的重要课题。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供长链非编码RNALINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用。长链非编码RNALINC00336定位于染色体6p21.31，GeneBank登录号：NR-027908.1(长链非编码RNALINC00336序列见SEQNO:1)。在前期研究工作中，专利技术人在肺鳞癌组织中提取RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR分析长链非编码RNALINC00336的表达，发现：长链非编码RNALINC00336在肺鳞癌组织中表达上调，与正常人肺组织中的表达差异显著(P<0.0001)(图1)。且长链非编码RNALINC00336表达水平不同的肺鳞癌患者预后存在明显差异，经Kaplan-Meier生存分析发现长链非编码RNALINC00336高表达的肺鳞癌患者生存率明显低于低表达的患者(P＝0.0290)(图2)，比率风险模型预后分析发现长链非编码RNALINC00336的风险率<1(HR＝0.3615)，表明长链非编码RNALINC00336高表达的患者预后较低表达的患者预后差，长链非编码RNALINC00336的高表达是肺鳞癌患者预后风险预测的独立危险因素。因此，长链非编码RNALINC00336能作为肺鳞癌预后的判断标准，作为生物标志物用于制备肺鳞癌患者的预后制剂，更进一步能够提供一种性价比高，易于推广应用的肺鳞癌预后预测试剂盒。所述肺鳞癌预后检测试剂盒中包括长链非编码RNALINC00336实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物：5′-CCACTGAGCAGAGGTGCTGGC-3′(SEQIDNO.2)；反向引物：5′-GTGCAGTGGCTCACGCCTATAA-3′(SEQIDNO.3)。优选地，所述试剂盒中还包括ACTB内参实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物：5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′(SEQIDNO.4)；反向引物：5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′(SEQIDNO.5)。将长链非编码RNALINC00336用于肺鳞癌患者预后的检测方法如下：(1)收集待测个体术后切除的肺鳞癌组织，抽提总RNA；(2)以总RNA为模板将长链非编码RNALINC00336逆转录为cDNA；(3)用长链非编码RNALINC00336特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得相对表达量2ΔΔCT，当2ΔΔCT>5.23时提示长链非编码RNALINC00336为高表达。综上，利用本专利技术的检测制剂可以检测长链非编码RNALINC00336在肺鳞癌患者中的表达水平，为肺鳞癌患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。附图说明图1为实时荧光定量PCR分析长链非编码RNALINC00336在肺鳞癌组织与正常肺组织中的表达差异；图2为长链非编码RNALINC00336与35例肺鳞癌患者预后的关系。具体实施方式实施例1制备长链非编码RNALINC00336用于肺鳞癌预后检测试剂盒(50次反应)1.RNA稳定溶液50ml2.异丙醇100ml3.三氯甲烷100ml4.Trizol50ml5.无酶水10ml6.1μM随机逆转录引物50ul7.5×逆转录缓冲液200ml8.10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸100ul9.40U/μlRNA酶抑制剂500ul10.200U/μlMMLV逆转录酶50ul11.PremixExTaq50ul12.10μM长链非编码RNALINC00336实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物5′-CCACTGAGCAGAGGTGCTGGC-3′(SEQIDNO.2)，反向引物5′-GTGCAGTGGCTCACGCCTATAA-3′(SEQIDNO.3)，13.10μM内参ACTB实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物为5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′(SEQIDNO.4)，反向引物为5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′(SEQIDNO.5)。实施例2肺鳞癌组织中长链非编码RNALINC00336检测1、肺鳞癌组织的保存：收集待测肺鳞癌组织存放于盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。2、组织中RNA的抽提：取适量标本于经180℃烘烤6-8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1mlTrizol研钵标本，研磨成液体状后用移至离心管管，加氯仿200μl/ml于离心管中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min；小心取上层水相入新离心管中，加入预冷的异丙醇0.5ml混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入75％无核酶水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入无核酶水10-20μl溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，OD26本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.长链非编码RNA LINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.长链非编码RNALINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用。2.长链非编码RNALINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测试剂盒中的应用。3.一种肺鳞癌预后检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括长链非编码RNALINC00336实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物：5′-CCACTGAGCAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶永光，王敏，毛超，刘双，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，王敏，
类型：发明
国别省市：湖南,43