DNA合成测序方法与测序系统技术方案

本发明专利技术公开了一种DNA合成测序方法和测序系统，所述方法包括：通过水溶性双功能连接单元将引物P1连接于基体表面；在基体表面加入含待测DNA模板的溶液，然后进行等温表面放大反应；再将引物Pe加入基体表面，然后在基体表面加入四种碱基的荧光标记可逆终止剂的延伸反应溶液，进行延伸反应；然后对延伸后的DNA双链进行成像之后，加入相应的化学试剂，使荧光标记可逆终止剂的连接单元断裂。重复DNA链延伸和断裂步骤，完成多次循环测序，即得待测DNA模板核苷酸的碱基序列。本发明专利技术测序方法可用于DNA高通量合成测序，在所述测序条件下实验结果其读长至少为73碱基；如果双端测序，其读长至少为146，准确率至少为99.98％。

【技术实现步骤摘要】
DNA合成测序方法与测序系统
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种DNA合成测序方法与测序系统。
技术介绍
人类基因组测序计划的完成，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNAsequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列顺序。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学等具有重要意义。合成法测序(SequencingBySynthesis，SBS)是第二代DNA测序技术之一。合成法测序通过把大量待测模板DNA片段固定，并在固定的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，然后四种碱基荧光标记核苷酸依次在DNA引物上延伸、断裂，通过荧光倒置显微镜检测荧光素，实现高通量并行的DNA序列测定。在合成法测序中，通过可裂解连接单元(CleavableLinker)将荧光素与核苷酸连接起来形成的可逆终止剂(ReversibleTerminator)，其电子效应与空间位阻在参与DNA延伸、断裂可裂解连接单元以便除去荧光素等过程中发挥着极为重要的作用，直接影响甚至决定测序的效率、读长等关键技术指标。为了确保参与DNA延伸时，当模板为连续多个相同碱基时，一次只延伸一个可逆终止剂，目前在Illumina公司广泛使用的可逆终止剂为3′-羟基阻断的修饰核苷酸。这样在测序过程中需要将标记的荧光素与3′-羟基保护基同时完全去掉，这样对测序试剂的结构设计、合成以及测序过程均提出了很高的要求。首先3'-OH保护的修饰核苷酸合成复杂；其次在实际测序过程中，使用3'-OH保护的可逆终止剂进行延伸之后需要将两个反应位点同时断裂，即连接单元100％断裂的同时也需要以100％效率将3'-OH去保护。但是这两个位点往往不能在相同条件下同时完全断裂，这势必导致错误信息不断累积，最终影响测序的读长和效率。而DNA测序需要100％去除，最后3'-OH保护的修饰核苷酸参与DNA链延伸时，面临的另一个巨大挑战为DNA聚合酶不易识别、延伸反应慢且容易错配(Ref:MichaelL.Metzker,NucleicAcidsResearch2012,40,7404；MichaelL.Metzker；NatureReviewsGenetics2010,11,31.)。基于二硫键连接单元的可逆终止剂在二代测序与单分子测序中均已得到应用，然而文献(NucleicAcidsResearch,2008,36,No.4e25)报道基于二硫键的可逆终止剂为单色荧光标记四个不同碱基的核苷酸，Helicos公司为了确保二硫键可逆终止剂作为单分子测序试剂一次只延伸一个可逆终止剂，在荧光素旁边又连接了一个位阻很大的核苷一磷酸或者二膦酸，空间位阻如此大的可逆终止剂的确能够做到一次只延伸一个，然而其合成路线极为繁杂，过大的位阻同时也造成参与DNA链延伸时酶不好识别且速度慢、错配率高(MichaelL.Metzker；NatureReviewsGenetics2010,11,31.)。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述缺点，本专利技术提供了一种DNA合成测序方法与测序系统。通过水溶性双功能连接单元将引物固定于玻璃表面，然后将待测DNA信息通过等温扩增表面放大原理复制于玻片表面，最后在DNA聚合酶作用下，将合成的四色荧光标记核苷酸在玻片表面延伸、成像、断裂并再次延伸，重复此循环，从而完成多次测序循环。本专利技术提供的测序系统与方法适用于任何DNA片段的测序。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术通过水溶性双功能连接单元将引物连接于基体表面，该双功能连接单元的一端通过酰胺键与基体上的氨基反应从而连接在基体表面，另一端通过点击化学反应与引物相连，将两端分别修饰了与引物P1序列互补但与Pe序列相同的待测DNA模板在基体表面通过等温扩增原理将大量待测DNA模板信息复制于流通池反应器。然后用TE缓冲液将上述经过等温扩增表面放大的流通池反应器洗涤，并加入引物Pe与固定在基体表面的待测DNA簇杂交，在DNA聚合酶作用下，加入延伸反应混合液，合成的四色荧光可逆终止剂即可参与DNA链延伸，形成含荧光的模板/引物核酸复合物。对延伸后的模板/引物核酸复合物进行荧光成像，以确定参与延伸的DNA碱基种类。加入相应的断裂用化学试剂(酸敏感连接单元需要加入酸性溶液，偶氮连接单元需要加入连二亚硫酸钠，二硫键需要加入DTT),使参与延伸的可逆终止剂上的连接单元断裂，对于二硫键断裂后还需要加入碘乙酰胺将新生成的巯基保护起来。重复上述延伸和断裂步骤，即获得待测模板核苷酸的碱基序列。具体来说，包括以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种DNA合成测序方法，包括以下步骤：A、通过水溶性双功能连接单元将引物P1连接于基体表面；B、在基体表面加入含待测DNA模板的溶液，然后加入表面放大反应液进行表面放大反应；C、经步骤B处理后，将引物Pe加入基体表面，然后在基体表面加入含预定浓度的四种不同荧光素标记四种不同碱基的可逆终止剂的延伸反应溶液，进行延伸反应；然后对延伸后的DNA双链进行荧光成像；D、成像之后，加入相应的断裂用化学试剂，使参与延伸后连接在DNA链上的四色荧光可逆终止剂中含有的链接单元断裂；E、重复步骤C和D，完成多次循环测序，即可获得待测DNA模板核苷酸的碱基序列。优选地，步骤D中，所述断裂用化学试剂选自酸性溶液、连二亚硫酸钠或DTT。对于酸敏感，需要加入酸性溶液；对于偶氮连接单元，需要加入连二亚硫酸钠；对于二硫键，需要加入DTT。且对于二硫键断裂后，还需要将新生成的巯基用碘乙酰胺保护。优选地，所述四种不同荧光素标记不同碱基的可逆终止剂中，采用的可裂解连接单元选自：酸敏感或二硫键SS或偶氮键所用的荧光素选自：形成的可逆终止剂为以下结构中的任意四种不同荧光素标记、不同碱基的可逆终止剂：dUTP可逆终止剂XIV,XIII,VI或XVII、dATP可逆终止剂XI,IX,XV或XIX、dCTP可逆终止剂XII,VII,XVI或XX、dGTP可逆终止剂VIII,X,XVIII或XXI，具体结构如下所示：我们设计合成了系列3′-OH未保护荧光标记核苷酸，该类修饰核苷酸作为测序用试剂，面临的最大挑战为当模板为连续多个相同碱基时，一次是否只能延伸一个可逆终止剂。我们的实验结果表明，我们发展的可逆终止剂具有延伸反应快、DNA聚合酶识别选择性高，不易发生错配且一次延伸反应只延伸一个可逆终止剂。本专利技术所述的可逆终止剂在文献基础上进行结构调整和优化，能够做到在DNA聚合酶作用下，当模板为连续多个相同碱基时一次只延伸一个可逆终止剂，并且可实现100％断裂，反应干净、彻底，完美解决了3′-OH未保护核苷酸用于DNA测序时可能遇到的最大问题。可逆终止剂已经引起广泛重视，然而不论是在二代合成测序还是三代单分子测序中，均很难做到一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，而我们经过结构调整以及DNA聚合酶的优化组合，做到了一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，这一点对于DNA测序是非常重要的发现。在上述步骤A之前，还包括对基体表面进行活化和修饰的步骤；所述活化步骤具体为：将干净的基体置于双氧水和浓硫酸的混合液中，在80-90℃下加热1h，使基体表面羟基化；所述的修饰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA合成测序方法，其特征在于，包括以下步骤：A、通过水溶性双功能连接单元将引物P1连接于基体表面；B、在基体表面加入含待测DNA模板的溶液，然后加入表面放大反应液进行表面放大反应；C、经步骤B处理后，将引物Pe加入基体表面，然后在基体表面加入含预定浓度的四种不同荧光素标记不同碱基的可逆终止剂的延伸反应溶液，进行延伸反应；然后对延伸后的DNA双链进行荧光成像；D、荧光成像之后，加入断裂试剂，使参与延伸后连接在DNA链上的四色荧光可逆终止剂中含有的链接单元断裂；E、重复步骤C和D，完成多次循环测序，即可获得待测DNA模板核苷酸的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种DNA合成测序方法，其特征在于，包括以下步骤：A、通过水溶性双功能连接单元将引物P1连接于基体表面；B、在基体表面加入含待测DNA模板的溶液，然后加入表面放大反应液进行表面放大反应；C、经步骤B处理后，将引物Pe加入基体表面，然后在基体表面加入含预定浓度的四种不同荧光素标记不同碱基的可逆终止剂的延伸反应溶液，进行延伸反应；然后对延伸后的DNA双链进行荧光成像；D、荧光成像之后，加入断裂试剂，使参与延伸后连接在DNA链上的四色荧光可逆终止剂中含有的链接单元断裂；E、重复步骤C和D，完成多次循环测序，即可获得待测DNA模板核苷酸的碱基序列。2.根据权利要求1所述的DNA合成测序方法，其特征在于，所述四种不同荧光素标记不同碱基的可逆终止剂中，采用的可裂解连接单元选自：酸敏感或二硫键SS或偶氮键所用的荧光素选自：形成的可逆终止剂为以下结构中的任意四种不同荧光素标记、不同碱基的可逆终止剂：3.根据权利要求1所述的DNA合成测序方法，其特征在于，步骤A之前，还包括对玻片表面进行活化和修饰的步骤；所述活化步骤具体为：将干净的基体置于双氧水和浓硫酸的混合液中，在80-90℃下加热1h，使基体表面羟基化；所述的修饰步骤具体为：将经活化步骤后的基体在溶剂中与氨丙基三乙氧基硅烷在60℃下加热反应2小时，得到表面带有氨基的基体。4.根据权利要求1所述的DNA合成测序方法，其特征在于，步骤A中，所述水溶性双功能连接单元包括以下结构式中的至少一种：5.根据权利要求1所述的DNA合成测序方法，其特征在于，步骤A具体包括以下步骤：A1、将基体置于...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉梅，谭连江，邵志峰，龚兵，李小卫，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31