表达CD40L的哺乳动物细胞及其用途制造技术

本文报道了用于在存在IL‑2和IL‑21的情况下共培养兔B‑细胞集合或单个放置的兔B‑细胞的共培养系统，其中表达CD40L的CHO细胞用作饲养细胞。

【技术实现步骤摘要】
表达CD40L的哺乳动物细胞及其用途本申请是申请日为2012年11月21日、专利技术名称为“表达CD40L的哺乳动物细胞及其用途”的中国专利申请201280057401.X(国际申请号PCT/EP2012/073232)的分案申请。本专利申请是B-细胞培养领域。本文报道了这样的培养系统，其用于刺激和扩展兔和人来源的抗体分泌细胞，如激活的B-细胞、成浆细胞以及在存在兔或人表达CD40L的饲养细胞的情况下从疾病中存活后免疫的兔或人分离的B-细胞。专利技术背景已经报道，来自不同物种的分离的B-细胞、成浆细胞和浆细胞难以在体外进行培养。实际上，这正常通过将原代B-细胞与杂交瘤配偶体融合产生无限增殖B-细胞系或无限增殖化来克服。对于兔，还开发了浆细胞瘤融合配偶体(Spieker-Polet,H.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)9348-9352，但是杂交瘤技术在兔中不能很好地运行。对于兔B-细胞在体外的持续存活，提供必要的激活刺激剂和存活因子是必需的。已经描述了多种化合物，如IL-2、IL-4、IL-10及其他(参见例如Zubler,R.,等,Eur.J.Immunol.14(1984)357-363和J.Exp.Med.160(1984)1170-1183)。在生理学上,B-细胞在遭遇特异抗原加例如通过CD40/CD40L途径(综述于Néron,S.,等,Arch.Immunol.Ther.Exp.59(2011)25-40)和/或通过来自天然背景的细胞因子和/或生长因子，例如通过树状突细胞或T细胞辅助的额外激活后被激活。在体外系统中，可以通过与EL4-B5胸腺瘤细胞的共培养或添加可溶性的或固定化的抗CD40抗体或CD40L模拟CD40/CD40L的相互作用。仅有的系统缺少足够的效力并且仅描述了与使用不同饲养混合物(例如Zubler混合物；IL-4、IL-10等)(Zubler,R.，上文)或胸腺细胞上清液(TSN)的其他所需刺激剂的组合。Weitkamp,J-H.,等,(J.Immunol.Meth.275(2003)223-237)报道了针对来自利用荧光病毒样颗粒选择的单个抗原特异性B-细胞的轮状病毒产生重组人单克隆抗体。在US2006/0051348中报道了针对多个近亲抗原产生多个分离抗体的方法。在WO2008/144763和WO2008/045140中分别报道了针对IL-6的抗体及其用途，以及用于获得抗原特异性B-细胞的克隆群体的培养方法。在US2007/0269868中报道了用于获得抗原特异性B-细胞的克隆群体的培养方法。Masri等(在Mol.Immunol.44(2007)2101-2106中)报道了从针对炭疽毒素的单个人淋巴细胞中获得的功能性Fab片段在大肠杆菌(E.coli)中的克隆与表达。在WO2007/031550中报道了用于制备免疫球蛋白文库的方法。在WO2009/10515中报道了制备表达有用的抗体的杂交细胞的方法。在WO2008/085878中报道了中和葡萄球菌(Staphylococcus)肠毒素B的高亲和力抗体。Amanna,I.J.和Slifka,M.K.报道了通过两种独立的且互补的方法定量稀有的记忆B-细胞群体(J.Immunol.Meth.317(2006)175-185)。在WO2011/052545中报道了用于产生抗原特异性B-细胞群体的方法。专利技术概述本文报道了用于从兔(或人)B-细胞开始快速、有效并可重复地产生兔(或人)抗体并包括至少一个培养步骤的新方法。本文进一步报道了可以与表达兔CD40L的哺乳动物细胞组合使用的饲养混合物，其提供高度有效的兔B-细胞刺激和培养系统。本文进一步报道了可以与表达人CD40L的哺乳动物细胞组合使用的饲养混合物，其提供高度有效的人B-细胞刺激和培养系统。如本文报道的一个方面是用于共培养兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的方法。如本文报道的一个方面是用于在存在IL-2和IL-21的情况下/与其一起共培养兔B-细胞与表达兔CD40L的哺乳动物细胞的方法。在一个实施方案中，表达兔CD40L的哺乳动物细胞是CHO或BHK细胞。如本文报道的一个方面是用于共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的方法。如本文报道的一个方面是用于在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下/与其一起共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的方法。在一个实施方案中，表达人CD40L的哺乳动物细胞是BHK或CHO细胞。在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。在一个实施方案中，所述共培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。在一个实施方案中，用于共培养的白细胞介素均是人白细胞介素。如本文报道的一个方面是用于产生兔抗体的方法，其包括以下步骤：培养分泌抗体的兔B-细胞和表达兔CD40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生兔抗体。在一个实施方案中，表达兔CD40L的哺乳动物细胞是CHO或BHK细胞。如本文报道的一个方面是用于产生兔抗体的方法，其包括以下步骤：在存在IL-2和IL-21的情况下/与其一起培养一个或多个分泌抗体的兔B-细胞和表达兔CD40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生兔抗体。在一个实施方案中，表达兔CD40L的哺乳动物细胞是CHO或BHK细胞。在一个实施方案中，在培养开始时加入IL-2和IL-21。在一个实施方案中，在培养开始时单独加入IL-2和IL-21。在一个实施方案中，兔B-细胞是未经处理的或非成熟的兔B-细胞。在一个实施方案中，所述B-细胞是IgG阳性的B-细胞(IgG+)。IgG阳性的B-细胞呈现可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。如本文报道的一个方面是用于产生人抗体的方法，其包括以下步骤：培养分泌抗体的人B-细胞和表达人CD40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生人抗体。在一个实施方案中，表达人CD40L的哺乳动物细胞是BHK或CHO细胞。如本文报道的一个方面是用于产生人抗体的方法，其包括以下步骤：在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下/与其一起培养一个或多个分泌抗体的人B-细胞和表达人CD40L的哺乳动物细胞并从培养上清液中回收抗体，由此产生人抗体。在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21的情况下。在一个实施方案中，所述培养是在存在IL-2和IL-21和IL-6的情况下。在一个实施方案中，用于培养的白细胞介素均是人白细胞介素。在一个实施方案中，表达人CD40L的哺乳动物细胞是BHK或CHO细胞。在一个实施方案中，在培养开始时加入白细胞介素。在一个实施方案中，在培养开始时单独加入白细胞介素。在一个实施方案中，人B-细胞是成熟的人B-细胞。在一个实施方案中，所述B-细胞是IgG阳性的B-细胞(IgG+)。IgG阳性的B-细胞呈现可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。如本文报道的一个方面是包含表达兔CD40L的CHO细胞和IL-2以及IL-21的试剂盒。如本文报道的一个方面是包含表达人CD40L的BHK细胞和IL-2和/或IL-21和/或IL-6的试剂盒。在一个实施方案中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于产生抗体的方法，其包括在存在IL‑2或IL‑21或IL‑6或其组合的情况下共培养人B‑细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的步骤。

【技术特征摘要】
2011.11.23 EP 11190341.51.用于产生抗体的方法，其包括在存在IL-2或IL-21或IL-6或其组合的情况下共培养人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞的步骤。2.权利要求1的方法，其特征在于所述B-细胞是非成熟的B-细胞。3.权利要求1-2任一项的方法，其特征在于共培养是在存在IL-2、或IL-2和IL-21、或IL-2和IL-21和IL-6的情况下。4.权利要求1-3任一项的方法，其特征在于所述B-细胞是单个放置的B-细胞。5.权利要求1-4任一项的方法，其特征在于所述B-细胞是IgG阳性的B-细胞(IgG+B-细胞)。6.IL-2和/或IL-21和/或IL-6用于共培养人B-细胞与饲养细胞的用途。7.权利要求6的用途，其特征在于所述饲养细胞是表达人CD40L的哺乳动物细胞。8.权利要求6-7任一项的用途，其特征在于使用IL-2、或IL-2和IL-21、或IL-2和IL-21和IL-6。9.用于培养分泌特异性结合T-细胞表面抗原并且介导阴性刺激物至T-细胞的抗体的人B-细胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下共培养人B-细胞和表达人CD40L的哺乳动物细胞。10.用于产生特异性结合抗原的抗体的方法，其包括以下步骤：a)在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情况下共培养分泌抗体的人B-细胞的集合或单个分泌抗体的人B-细胞与表达人CD40L的哺乳动物细胞，b)培养包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·恩德尔，J·菲舍尔，P·科恩，S·奥夫纳，J·普拉策尔，S·西伯尔，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH