一种酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，属于甜味剂生物合成技术领域。本发明专利技术用来源于Geobacillus sp.的环糊精葡萄糖基转移酶为催化剂，以甜菊糖苷为糖基受体，糊精或寡糖为糖基供体，以钙钡离子盐桥为主要稳定剂并联合甘油调整酶的构象和结合域开放度，变温分阶段利用淀粉酶的转苷和水解活性，从而以酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷。本发明专利技术技术可以提高酶的利用率，获得甜味和口感俱佳的葡萄糖基甜菊糖苷。

【技术实现步骤摘要】
一种酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法
本专利技术涉及一种酶促变温高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，属于甜味剂的生物合成

技术介绍
甜菊糖苷是甜叶菊提取物中糖苷分子的总称；由具有甜味的亲水性糖基与疏水性的甜菊醇苷元组成，已鉴定出约40种衍生物。其中莱鲍迪苷A(RebaudiosideA，RA)、RebaudiosideD和RebaudiosideM的味质口感较好，而斯替夫苷(Stevioside，St)、莱鲍迪苷C和其它低分子量甜菊糖苷却带有一定的轻微苦味或甘草余味，这种微苦余味降低了它作为天然甜味剂的品质。甜菊醇口感味质极差，具有严重的苦涩余味，这便赋予甜菊糖苷轻微苦味的特性。因此，除了具有苦味的杂质对甜菊糖苷口感味质有影响外，甜菊糖苷自身的分子结构是产生苦涩余味的重要因素。对甜菊糖苷口感进行改善可从苦味产生的原因出发，一方面除去疏水性苦味杂质，提高甜菊糖苷的纯度，尤其是提高味质甜度最好的RA的含量；另一方面是从分子结构上对甜菊糖苷进行改性，利用酶法糖基化等方法引入糖基对其口感味质进行改善。在甜菊糖苷上嫁接其它基团使外围基团远离甜菊醇苷元，就有可能改善其后苦味；比如对甜菊糖苷进行适度的糖苷化。甜菊糖苷的糖基化或称接枝改性包括化学催化、酶催化和全细胞催化。用于甜菊糖苷接枝改性的酶主要是糖基转移酶，目前尤以环糊精葡萄糖基转移酶(环糊精葡萄糖基转移酶)为代表，也有少量关于葡萄糖苷酶、呋喃果糖苷酶和半乳糖苷酶的报道。例如，采用来自嗜碱软性芽胞杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶，反应10h后，经纯化得到9种产物，结构分析显示在C-13位和C-19位通过α-1,4糖苷键分别连接了1到3个葡萄糖基，而C-13位连接1个或2个葡萄糖基时，味质与St相比都已改善；当C-13位连接3个葡萄糖基时，甜度则下降(Fukunaga,1989)。Lobov等利用商业化的葡萄糖基酶筛选出普鲁兰酶(Pullulanase)和真菌淀粉酶(BiozymeL)，用于甜菊糖苷的转苷反应，分别得到三种产物；但反应所需时间较长且产物收率小于10％(Lobov,1991)。Abelyan用环糊精作为糖基供体，得到九种转糖基产物，其中两种葡萄糖基甜菊糖苷的甜味特性较好，但产率较低，产率之和为11.6％(AbelyanVA,2004)。Kochikyan用六种菌株生产出不同种类的环糊精葡萄糖基转移酶，以液化淀粉作为糖基供体催化甜菊糖苷转苷，得到七种转糖基产物(KochikyanVT,2006)。Jaitak等首次将微波辅助手段应用于酶法改性甜菊糖苷，以β-环糊精作糖基供体，用来源于Bacillusfirmus的β-环糊精葡萄糖基转移酶在微波功率80W，反应温度50℃，pH7.0的磷酸缓冲液中反应，主要得到两种α-1,4-葡糖基衍生物，66％的4’-O-alpha-D-葡萄糖基斯替夫苷和24％的4”-O-alpha-D-麦芽糖基斯替夫苷，甜菊糖苷的苦涩味明显降低(JaitakV,2009)。Yamamoto等用环糊精葡萄糖基转移酶催化甜菊糖苷进行α-l，6位的转糖基反应，甜菊糖苷和淀粉在环糊精葡聚糖酶的催化下反应4h，得到单取代和双取代的葡萄糖接枝产物，产率分别为35.7％和42.9％。等研究反应机理后推断造成α-l，6位的转糖基化作用弱于α-1，4位的转糖基化作用的原因是糖基受体上葡萄糖基的连接方式(YamamotoK,1994)。佟树敏在50℃下以玉米淀粉作为糖基供体，加入β-环糊精葡萄糖基转移酶对甜菊糖苷进行酶法改性，反应48h后产率为35.5％(佟树敏,1998)。低通量条件下，我们用α-环糊精葡萄糖基转移酶Toruzyme3.0L和α-中温淀粉酶双酶法催化水解淀粉改性St，得到十四种甜菊糖苷衍生物；产物的后苦涩味明显改善，口感清甜。优化得到反应的最佳条件：斯替夫苷0.01g/mL，淀粉0.01g/mL，温度60℃，淀粉与斯替夫苷的质量比1：1，环糊精葡萄糖基转移酶的酶活100U/g斯替夫苷，反应4h，St转化率达到77.11％。甜度最高的St-Glc1和St-Glc2的产率最高。其后，我们又以环糊精和斯替夫苷为底物，以10U/g斯替夫苷的加酶量，反应5h后斯替夫苷的转化率最高可达到87.8％。而以性价比较高的玉米淀粉水解液为糖基供体时，在最佳工艺条件下斯替夫苷的转化率为59.9％；以50W微波辐射，55℃下β-环糊精与斯替夫苷的质量比为1.5：1，加酶量10U/g斯替夫苷，反应1min时，斯替夫苷的转化率即达50.5％，但高接枝度的产品较多，口感不好。美国专利US4219571和US7807206利用嗜热脂肪芽孢杆菌产的环糊精葡萄糖基转移酶，得到具有高达10的聚合度的α-1,4葡糖基衍生物。美国专利US8257948、US8318459和中国专利CN105899670A以淀粉为底物，先采用α-淀粉酶和环糊精葡萄糖基转移酶处理淀粉，再向反应液中二次添加环糊精葡萄糖基转移酶，随后再经过淀粉酶或其他糖酶的处理，得到α-1,4-葡糖基衍生物，生产工艺繁琐，成本增加。其中中国专利CN105899670A将淀粉加入到水中以形成淀粉悬浮液；再将α-淀粉酶和环糊精葡萄糖基转移酶的混合物加入到淀粉悬浮液中并在约75-80℃下孵育约0.5至2小时，生成液化淀粉悬浮液后通过低pH热处理将α-淀粉酶灭活；然后将甜菊醇糖苷加入到液化淀粉悬浮液中，生成反应混合物，再将第二批环糊精葡萄糖基转移酶加入到反应混合物中并在约5-125℃下孵育约1至168小时；随后加入一种或几种糖酶，将反应混合物在约5-125℃下孵育约0.0001-168小时，其中葡糖基甜菊组合物包含具有二十个或更少的α-1，4-葡糖基残基的甜菊醇糖苷衍生物。所得到的产品使用离子交换树脂或膜进行脱色；再将脱色后的反应混合物与大孔吸附树脂接触来除去非甜菊糖苷化合物并随后用醇或含水醇洗脱吸附的甜菊糖苷；将洗脱液通过填充有离子交换树脂的柱或膜来进行脱盐；从洗脱液中除去醇，获得含水洗脱液；将含水洗脱液浓缩并干燥以获得干燥的葡糖基甜菊糖苷。上述方法中都涉及到的环糊精葡萄糖基转移酶属于糖酶，该酶的一个特性是结构域对多种底物有区分度，因而反应时通量较低，生产效率需要提高。环糊精葡萄糖基转移酶的另外一个特性是耐热性能较差，已知三维结构的环糊精葡萄糖基转移酶如BC251环糊精葡萄糖基转移酶在温度为60℃时活性半衰期为10min，B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶在75℃时活性半衰期为10min。ThermococcuskodakaraensisKOD122和ThermococcusstrainB1001环糊精葡萄糖基转移酶的活性半衰期分别为100℃时20min和110℃时40min。通过对文献的对比、归纳总结可知，盐桥、pH和有机溶剂都能改变酶的活性和热稳定性，但是目前还没有规律可循，也不具备普适意义——甚至同一种酶在不同反应体系里的有效稳定剂也不同。环糊精葡萄糖基转移酶催化反应时，底物与淀粉结合后，酸催化剂Glu257将质子给位于亚位点+1和－1葡萄糖间的氧，此键断裂后－1葡萄糖形成过渡态，这种氧碳正离子型的过渡态经正电荷移位形成双键结构，构成平面构像；然后经b-糖苷键连接至亲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶促变温制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，其特征在于，用环糊精葡萄糖基转移酶为催化剂，以甜菊糖苷为糖基受体，糊精或寡糖为糖基供体，以盐和多元醇为酶复合稳定剂，水相酶促变温下高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷。

【技术特征摘要】
1.一种酶促变温制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，其特征在于，用环糊精葡萄糖基转移酶为催化剂，以甜菊糖苷为糖基受体，糊精或寡糖为糖基供体，以盐和多元醇为酶复合稳定剂，水相酶促变温下高通量制备葡萄糖基甜菊糖苷。2.根据权利要求1所述的一种酶促变温制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，其特征在于，在80-85℃下将甜菊糖苷和糖基供体溶于一定pH环境的水或缓冲液中，冷却到60-65℃后，向其中加入10-100U/g甜菊糖苷的环糊精葡萄糖基转移酶及酶稳定剂，保持温度开始反应0.5-5h，然后升温到70-76℃反应8-24h，最后升温到75-85℃反应8-24h，至原料甜菊糖苷含量的变化低于每小时0.1％时结束反应。3.根据权利要求1所述的一种酶促变温制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，其特征在于，所用的环糊精葡萄糖基转移酶为来源于Geobacillussp.菌株生产的环糊精葡萄糖基转移酶或其固定化酶。4.根据权利要求2所述的一种酶促变温制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，其特征在于，甜菊糖苷水溶液的质量浓度为10％-25％，甜菊糖苷：糖基供体按质量比为1:0.3-1:1.1。5.根据权利要求1或2所述的一种酶促变温制备葡萄糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏咏梅，朱理平，方云，刘湘，王海军，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32