本发明专利技术提供一种热稳定DNA扩增融合酶。该热稳定DNA扩增融合酶由Taq DNA聚合酶与一种来自于海洋纳米古菌（Nanoarchaeum equitans）的DNA结合蛋白相连接获得，所述结合通过Taq DNA聚合酶与DNA结合蛋白通过构建融合蛋白载体进行原核表达实现。表达后的产物保持了Taq DNA聚合酶的聚合活性，同时DNA结合蛋白与PCR反应中的DNA模板‑引物复合体具有较强的结合作用，极大增强了PCR反应的效率。使用该方法制备的DNA扩增融合酶不仅可以广泛使用于分子生物学等科研领域，还可以应用于临床分子诊断、法医学检测、食品及环境监测等多个领域。
【技术实现步骤摘要】
一种热稳定DNA扩增融合酶
本专利技术涉及一种热稳定DNA扩增融合酶，属于生物技术的应用领域。
技术介绍
获得过诺贝尔奖的PCR(PolymeraseChainReaction)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，它的目的是使得DNA片断在短时间内迅速扩增。通过PCR技术不仅可以扩增存在于样品中的DNA，也可以富集混合DNA分子中的任一种。PCR的重要价值在于扩增存在微量而特殊的DNA序列。被许多科学家视为近几十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。Taq酶是从水生栖热菌ThermusAquaticus(Taq)中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶，对于PCR的应用有里程碑的意义。PCR循环包括变性（90°C左右）、退火（50°C左右）、延伸（70°C左右），每一步对温度的要求都不一样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷。同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，可以将底物模板在很短的1-2个小时内增加几千万到几十亿倍。特别是实时荧光定量PCR(real-timePCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，其以特异性强、灵敏度高、自动化、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，成为分子生物学和分子诊断的重要技术平台，并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断。PCR的性能及其结果的精确度和准确度通常与热稳定性DNA聚合酶有关，酶的选择是反应成功的关键。因此在科研或临床上，DNA聚合酶对各种极低浓度的微量样品的扩增效率是直接导致PCR成败的重要因素。影响PCR扩增效率的一个主要因素是DNA聚合酶与DNA模板-引物复合体的结合能力。在反应的设置中，常规DNA聚合酶与DNA模板-引物复合物的相互作用是基于DNA聚合酶本身的三维构象，所以，如何在不改变其热稳定性的前提下，通过改变DNA聚合酶的蛋白质结构从而增强其与模板-引物复合物的结合和相互作用、降低对模板结构的敏感性、增强对高GC含量等困难模板的扩增能力成为了提高Taq酶扩增效率的重要研究方向。
技术实现思路
基于以上原因，本专利技术的目的在于优化设计并表达纯化出一种具有较高扩增效率的热稳定DNA扩增融合酶，以及其制备方法，并进一步提供了该热稳定DNA扩增融合酶的氨基酸和基因编码信息。其成果可广泛使用于分子生物学等科研领域，及临床分子诊断、法医学检测、食品及环境监测等多个领域。为实现上述目的，本专利技术通过如下技术方案实现：一种热稳定DNA扩增融合酶，采用如下步骤：步骤一：采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQNO.1和SEQNO.2所显示的核苷酸序列，将两部分所显示的核苷酸序列，通过6个氨基酸GTGTGG所组成的连接序列相连接；步骤二：再将以上所述两部分核苷酸序列和连接序列通过引物重叠PCR连接起来的过程中，对全长片段进行连接时，在上下游引物的两端分别加上EcoRI和SalI两个限制性内切酶的识别和酶切位点，同时在下游引物上加上终止密码；全长扩增后，得到SEQNO.3所示全长序列，经过双酶切连接到pET28a(+)载体的相应位点，转化大肠杆菌DH5alpha,在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，提取重组质粒，进行双酶切和测序鉴定，选择含有正确重组质粒的菌落进行保存；步骤三：然后将正确的重组质粒转化到制备的高效感受态大肠杆菌表达菌株BL21中，在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，保存待用；步骤四：挑选基因工程菌单菌落于含有终浓度为50ug/ml卡那霉素的100ml液体LB培养基中，37℃过夜培养；第二天在5个100ml的培养瓶中加入含有终浓度为50ug/ml卡那霉素的50ml液体LB培养基，将含有过夜培养基因工程菌的菌液按照1:20的比例加入，37℃培养4小时，待OD600达到0.8左右时，其中一个培养管不加IPTG诱导剂，另外四管，两两各加入0.5mM和1mMIPTG，两两各在30℃和37℃诱导培养5小时；5000rpm、10分钟、4℃离心收集和洗涤菌体，重悬于缓冲溶液中，在冰上用超声法破碎细胞，功率100V、间隔5秒、30个循环、循环三次，再4℃、12000rpm离心20分钟，取上清，-20℃冻存；按照胶厚度0.75cm，浓缩胶5%，80V电泳，10%分离胶，120V电泳，进行SDS-PAGE电泳；电泳得到的目的片段的大小为108KD左右，与SEQNO.3所显示的融合酶基因编码的蛋白大小基本一致，融合酶的最佳表达条件为1mMIPTG,37℃诱导培养5小时；步骤五：进行2L级别的发酵培养,诱导和纯化；2L级别的发酵培养和诱导的条件按照步骤四中表达条件确立的方法进行；采用XZ-8M型人容量低温高速离心机,5000rpm,5分钟,4°C离心去菌液，收集菌体；再重悬于100ml(50mMNaH2P04,500mMKCl,10mMImidazolcpH8.0)缓冲液中,震荡离心4'C离心收集菌体,以去除LB液体培养基残留；将沉淀后菌泥重悬于以上同样溶液中，在上述重悬中加入终浓度为2mMDTT、1mMPMSF利0.5mMEDTA,采用HN92-II超声破碎仪,Q6号变辐杆,冰浴、功率400伏、超声4S、间息5s,30个循环、循环五次,再4℃、10000rpm离40分钟,取上清,采用0.45μm过滤器过滤除颗粒,-20℃冻存待用；然后再采用APPSMV50D蛋白纯化仪器对过滤后的上清进行纯化，100ml上样，用溶液(50mMNaH2P04,500mMKC1,20mMImidazole,2mMDTTpH8.0)洗涤到基线，Protio@NI-NTA10ml预装亲和柱咪唑梯度洗脱;SephdexG-25脱盐柱脱盐;SP阳离子柱离子梯洗脱;Superdex200分子筛柱分离;50ml的50KD超滤管浓缩,再加入终浓度为50%的甘油、0.5%Tween-20、0.5%NP-40和200μg/mlBSA，得到6ml(2.5mg/ml)融合酶蛋白。采用上述技术方案的有益效果是：1)本专利技术的热稳定DNA扩增融合酶中的DNA结合蛋白能在PCR反应体系里面增强酶与DNA模板-引物复合物的相互作用，降低对模板结构的敏感性，从而增强了TaqDNA聚合酶的聚合活性，由于融合的蛋白也是来源于一种耐高温的古菌菌株，使得融合酶扩增时依然具有耐高温的特性，同时，具有更强的特异性和扩增效率。2)本专利技术的热稳定DNA扩增融合酶可广泛应用于高灵敏度和有较强背景基因组扩增(如基因组中某个特定基因位点或外源病原体的检测)、DNA序列测定、MultiplexPCR、TA克隆等。3)本专利技术提供的制备热稳定DNA扩增融合酶方法能简单、有效的制备具有稳定增强PCR反应效率的DNA聚合酶。附图说明图1为电泳的结果示意图。图2为纯化后的电泳结果示意图。图3为扩增后的电泳结果A示意图。图4为扩增后的电泳结果B示意图。具体实施方式实施例一：融合酶基因工程菌的建立1、融合基因序列的合成采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种热稳定DNA扩增融合酶，其特征在于：它采用如下步骤：步骤一：采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQ NO.1和SEQ NO.2所显示的核苷酸序列，将两部分所显示的核苷酸序列，通过6个氨基酸GTGTGG所组成的连接序列相连接；步骤二：再将以上所述两部分核苷酸序列和连接序列通过引物重叠PCR连接起来的过程中，对全长片段进行连接时，在上下游引物的两端分别加上EcoRI和SalI两个限制性内切酶的识别和酶切位点，同时在下游引物上加上终止密码；全长扩增后，得到SEQ NO.3所示全长序列，经过双酶切连接到pET28a(+)载体的相应位点，转化大肠杆菌DH5alpha,在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，提取重组质粒，进行双酶切和测序鉴定，选择含有正确重组质粒的菌落进行保存；步骤三：然后将正确的重组质粒转化到制备的高效感受态大肠杆菌表达菌株BL21中，在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，保存待用；步骤四：挑选基因工程菌单菌落于含有终浓度为50ug/ml卡那霉素的100ml液体LB培养基中，37℃过夜培养；第二天在5个100ml的培养瓶中加入含有终浓度为50ug/ml卡那霉素的50ml液体LB培养基，将含有过夜培养基因工程菌的菌液按照1:20的比例加入，37℃培养4小时，待OD600达到0.8左右时，其中一个培养管不加IPTG诱导剂，另外四管，两两各加入0.5mM和1mMIPTG，两两各在30℃和37℃诱导培养5小时；5000rpm、10分钟、4℃离心收集和洗涤菌体，重悬于缓冲溶液中，在冰上用超声法破碎细胞，功率100V、间隔5秒、30个循环、循环三次，再4℃、12000rpm离心20分钟，取上清，‑20℃冻存；按照胶厚度0.75cm，浓缩胶5%，80V电泳，10%分离胶，120V电泳，进行SDS‑PAGE电泳；电泳得到的目的片段的大小为108KD左右，与SEQ NO.3所显示的融合酶基因编码的蛋白大小基本一致，融合酶的最佳表达条件为1mM IPTG,37℃诱导培养5小时；步骤五：进行2L级别的发酵培养,诱导和纯化；2L级别的发酵培养和诱导的条件按照步骤四中表达条件确立的方法进行；采用XZ‑8M型人容量低温高速离心机,5000rpm,5分钟,4°C离心去菌液，收集菌体；再重悬于100ml (50mM NaH2P04,500mM KCl,10mM Imidazolc pH8.0) 缓冲液中,震荡离心4'C离心收集菌体,以去除LB液体培养基残留；将沉淀后菌泥重悬于以上同样溶液中，在上述重悬中加入终浓度为2mM DTT、1mM PMSF利0.5mM EDTA,采用HN92‑II超声破碎仪,Q6号变辐杆,冰浴、功率400伏、超声4S、间息5s,30个循环、循环五次,再4℃、10000rpm离40分钟,取上清,采用0.45μm过滤器过滤除颗粒,‑20℃冻存待用；然后再采用APPS MV 50D蛋白纯化仪器对过滤后的上清进行纯化，100ml上样，用溶液(50mM NaH2P04,500mM KC1,20mM Imi dazole, 2mM DTT pH8.0) 洗涤到基线，Protio@NI‑NTA 10ml预装亲和柱咪唑梯度洗脱;Sephdex G‑25脱盐柱脱盐;SP阳离子柱离子梯洗脱; Superdex 200分子筛柱分离;50ml的50KD超滤管浓缩,再加入终浓度为50%的甘油、0.5% Tween‑20、0.5% NP‑40和200μg/ml BSA，得到6ml (2.5mg/ml) 融合酶蛋白。...
【技术特征摘要】
1.一种热稳定DNA扩增融合酶，其特征在于：它采用如下步骤：步骤一：采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQNO.1和SEQNO.2所显示的核苷酸序列，将两部分所显示的核苷酸序列，通过6个氨基酸GTGTGG所组成的连接序列相连接；步骤二：再将以上所述两部分核苷酸序列和连接序列通过引物重叠PCR连接起来的过程中，对全长片段进行连接时，在上下游引物的两端分别加上EcoRI和SalI两个限制性内切酶的识别和酶切位点，同时在下游引物上加上终止密码；全长扩增后，得到SEQNO.3所示全长序列，经过双酶切连接到pET28a(+)载体的相应位点，转化大肠杆菌DH5alpha,在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，提取重组质粒，进行双酶切和测序鉴定，选择含有正确重组质粒的菌落进行保存；步骤三：然后将正确的重组质粒转化到制备的高效感受态大肠杆菌表达菌株BL21中，在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，保存待用；步骤四：挑选基因工程菌单菌落于含有终浓度为50ug/ml卡那霉素的100ml液体LB培养基中，37℃过夜培养；第二天在5个100ml的培养瓶中加入含有终浓度为50ug/ml卡那霉素的50ml液体LB培养基，将含有过夜培养基因工程菌的菌液按照1:20的比例加入，37℃培养4小时，待OD600达到0.8左右时，其中一个培养管不加IPTG诱导剂，另外四管，两两各加入0.5mM和1mMIPTG，两两各在30℃和37℃诱导培养5小时；5000rpm、10分钟、4℃离心收集和洗涤菌体，重悬于缓冲溶液中，在冰上用超声法破碎细胞，功率100V、间隔...
【专利技术属性】
技术研发人员：张健，夏春丽，罗宇森，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52
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