一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法技术

技术编号:18279667 阅读:28 留言:0更新日期:2018-06-23 20:25
本发明专利技术公开了一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法,包括以下步骤:1)预处理:加热发酵液、冷却后离心除去菌体、变性蛋白等不溶物;2)絮凝与浓缩:上清液中加入适量壳聚糖、混匀,在适宜温度下自然沉降,弃掉上层液相;3)洗脱:蒸馏水清洗去除沉淀物中的残余发酵液后,加入适宜浓度的NaHCO3溶液,洗脱沉淀物中的鼠李糖脂,收集洗脱液;4)获取:调节洗脱液pH、静置沉淀、离心,获得鼠李糖脂产物。本发明专利技术方法是一种简便、高效提取发酵液中鼠李糖脂的方法,在鼠李糖脂发酵生产领域具有重要应用价值。

A method for extracting rhamnolipid products from fermentation broth

The invention discloses a method for extracting rhamnolipid products in the fermentation broth, including the following steps: 1) preprocessing: heating the fermentation liquid, removing the insoluble substances, such as the bacteria and the denatured protein after cooling; 2) flocculation and concentration: adding proper amount of chitosan to the supernatant, mixing, natural settlement at the appropriate temperature and abandoning the upper liquid phase at the suitable temperature. 3) elution: the distilled water cleaning and removing the residual fermentation liquid in the sediment, adding the suitable concentration of NaHCO3 solution, eluting the rhamnolipid in the precipitate, collecting the eluant; 4) obtaining: adjusting the eluent, settling and centrifugation, and obtaining the rhamnolipid products. The method is simple and efficient for extracting rhamnolipid from fermentation broth, and has important application value in the field of rhamnolipid fermentation.

【技术实现步骤摘要】
一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法
本专利技术属于鼠李糖脂发酵生产领域,具体地说,它涉及一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法。
技术介绍
鼠李糖脂是由铜绿假单胞菌等细菌代谢合成的一种生物表面活性剂,因其具有表面活性高、临界胶束浓度低,安全无毒、可生物降解等优势,因而在微生物采油、环境污染修复、食品、生物医药等
具有广泛的应用前景。鼠李糖脂产生菌的发酵液成分复杂,从发酵液中提取鼠李糖脂的成本高、难度较大。目前,从发酵液中提取鼠李糖脂的方法主要为氯仿-甲醇萃取法、硅胶柱层析法等,在萃取法和柱层析法中需要用到大量的氯仿,而氯仿是一种高毒性的有机氯化物,危害人体和环境。上述提取方法的高成本和高毒性限制了鼠李糖脂的发酵生产和应用。因此,获得一种简便、绿色的鼠李糖脂产物提取方法,将能够解决上述瓶颈问题。本专利技术的鼠李糖脂提取方法不需要使用氯仿和甲醇等有毒溶剂,为绿色提取工艺。因此,该提取发酵液中鼠李糖脂的方法,在鼠李糖脂的发酵生产领域将具有重要的应用价值。
技术实现思路
:为了克服上述现有技术的不足,本专利技术提供了一种简便、高效提取发酵液中鼠李糖脂的方法。为实现上述目的,本专利技术采用的技术方案为:一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法,包括以下步骤:1)预处理:加热发酵液、冷却后离心除去菌体、变性蛋白等不溶物;2)絮凝与浓缩:上清液中加入适量壳聚糖,搅拌混匀,在适宜温度下自然沉降,弃掉上层液相;3)洗脱:蒸馏水清洗去除沉淀物中残余发酵液后,加入适宜浓度的NaHCO3溶液,洗脱沉淀物中的鼠李糖脂,收集洗脱液;4)获取:调节洗脱液pH、静置沉淀、离心,获得鼠李糖脂产物。将产鼠李糖脂菌种的种子液接种至含发酵培养基的培养体系中(如三角瓶、发酵罐等)中,在30~40℃、160~220rpm条件下,培养2~6天,得到的含鼠李糖脂的发酵液。种子液与发酵培养基的体积比为2-6:100。发酵培养基按质量分数为:碳源2~5%,NaNO30.2~0.4%,KH2PO40.1~0.3%,K2HPO4·3H2O0.1~0.3%,MgSO4·7H2O0.02~0.06%,酵母粉0.05~0.15%,余量为水;pH6.5~7.0。发酵培养基的碳源,可以为葡萄糖、蔗糖、甘油、糖蜜、大豆油。利用本专利技术方法提取发酵液中的鼠李糖脂产物,先对发酵液进行预处理,将发酵液放置在80~100℃水浴中加热处理20~60min;在8,000g~10,000g条件下,离心除去菌体和变性蛋白等不溶物。按照壳聚糖终浓度为5~20g/L,向预处理后发酵液中加入脱乙酰度≥90%的壳聚糖,搅拌混匀,然后在30~40℃下,絮凝沉降1~2h,然后弃掉上层液相。用20-50ml蒸馏水洗涤沉淀物3次,弃掉液相;加入20~50ml浓度为1~5g/L的NaHCO3水溶液重悬沉淀物,洗脱3次,收集洗脱液。用浓度1mol/L的HCl水溶液调节洗脱液的pH至1.5~2.0;在4~10℃条件下,静置8~12h;在10,000g~12,000g条件下,离心获得鼠李糖脂产物。利用薄层色谱法对提取到的鼠李糖脂产物进行定性分析,在苯酚-硫酸显色剂下,产物显示黄色,表明为鼠李糖脂。所述鼠李糖脂提取方法可以应用于鼠李糖脂的发酵生产领域,提取细菌发酵液中鼠李糖脂的产物。本专利技术的有益效果:本专利技术方法是一种简便、快捷提取发酵液中鼠李糖脂的方法;此外,利用本专利技术方法提取发酵液中鼠李糖脂,避免了有机溶剂的使用。具体实施方式结合下述具体实施例对本专利技术进行详细的说明,使本领域的普通技术人员更全面的理解本专利技术,但不以任何方式限制本专利技术。在如下实施例中,如无特殊说明,所用的材料和试剂均可从生化试剂公司购买获得;除特殊说明的方法外,所用试验方法均为实验室常规实验方法。实施例1:从以葡萄糖为碳源的发酵液中提取鼠李糖脂产物。1)发酵培养基的制备:用电子天平分别称量,30g葡萄糖,3gNaNO3,1gKH2PO4,2gK2HPO4·3H2O,0.4gMgSO4·7H2O,1g酵母粉;加入200ml蒸馏水混匀后,倒入容量瓶中,用蒸馏水定容至1L;加入质量分数30%的NaOH,调节培养基的pH至7.0;分装到三角瓶后,放置于115℃下灭菌30min。2)种子液制备:产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853的斜面菌种2接种环,接种到含100mlLB培养基的三角瓶中,在37℃、180rpm/min下,培养6-10小时,至OD600值为0.7,即得到培养至对数生长后期的种子液,菌数为105个/ml。3)含鼠李糖脂发酵液的制备:待灭菌后的发酵培养基冷却至室温(20-30℃)后,接种培养基体积3%的菌株ATCC27853的种子液(菌数为105个/ml),在37℃、180rpm条件下,培养4天,用于发酵生产鼠李糖脂,获得含鼠李糖脂的发酵液。参考文献(FengZhao,etal.,Comparisonofmethodstoquantifyrhamnolipidandoptimizationofoilspreadingmethod.TensideSurfactantsDetergents,2016,53(3):243-248.)中的排油圈方法,对发酵液中的鼠李糖脂含量进行定量,测得鼠李糖脂产量为3.16g/L。4)鼠李糖脂产物提取:培养结束后,将1000ml发酵液放置在80℃水浴中加热处理30min;冷却至室温后,在10,000g条件下,离心除去菌体等不溶物。向预处理后发酵液中加入10克脱乙酰度为95%的壳聚糖,搅拌混匀,然后在35℃下,絮凝沉降2h,然后弃掉上层液相。用30ml蒸馏水洗涤沉淀物,重复此过程共洗涤3次,弃掉液相;加入50ml浓度为5g/L的NaHCO3水溶液重悬沉淀物,自然沉降,收集液体作为洗脱液,重复此过程共3次,收集3次得到的洗脱液。用浓度1mol/L的HCl水溶液调节洗脱液的pH至2.0;在4℃条件下,静置12h;在10,000g条件下,离心收集固体,获得鼠李糖脂产物。待产物冷冻干燥后,称量得到鼠李糖脂产量为2.08g,计算鼠李糖脂产物的得率:2.08/3.16*100%=65.8%。5)鼠李糖脂产物定性分析:利用薄层色谱法对提取到的鼠李糖脂产物进行定性分析,将提取的鼠李糖脂产物溶于二氯甲烷中,将样品点在硅胶板上,在氯仿/甲醇/水=65:15:2(v/v/v)的展开剂中展开,用显色剂进行显色。在苯酚-硫酸显色剂下,产物显示黄色,说明利用该方法从葡萄糖为碳源的发酵液中提取到了鼠李糖脂产物。实施实施例2:所选择菌株、培养基成分、培养条件与实施例1相同,不同之处在于所用的壳聚糖具有不同的脱乙酰度,分别设置添加脱乙酰度为85%、90%和92%的3种壳聚糖的实验处理,利用本专利技术方法提取发酵液中鼠李糖脂。鼠李糖脂的得率分别为45.8%,60.8%和62.1%;结果表明,当壳聚糖的脱乙酰度≥90%时,鼠李糖脂产物的收率≥60%。实施例3:从以大豆油为碳源的发酵液中提取鼠李糖脂产物制备以大豆油为碳源的发酵培养基,用电子天平分别称量,3gNaNO3,1gKH2PO4,2gK2HPO4·3H2O,0.4gMgSO4·7H2O,1g酵母粉;加入200ml蒸馏水混匀后,倒入容量瓶中,用蒸馏水定容至1L;加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法,所述方法包括以下步骤:1)预处理:加热鼠李糖脂产生菌发酵液、冷却至室温后离心除去不溶物,得上清液;2)絮凝与浓缩:上清液中加入壳聚糖,搅拌混匀,自然沉降后,弃掉上层液相;3)洗脱:蒸馏水清洗去除沉淀物中残余发酵液后,加入NaHCO3溶液,洗脱沉淀物中的鼠李糖脂,收集洗脱液;4)获取:调节洗脱液pH、静置沉淀、离心,获得鼠李糖脂产物。

【技术特征摘要】
1.一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法,所述方法包括以下步骤:1)预处理:加热鼠李糖脂产生菌发酵液、冷却至室温后离心除去不溶物,得上清液;2)絮凝与浓缩:上清液中加入壳聚糖,搅拌混匀,自然沉降后,弃掉上层液相;3)洗脱:蒸馏水清洗去除沉淀物中残余发酵液后,加入NaHCO3溶液,洗脱沉淀物中的鼠李糖脂,收集洗脱液;4)获取:调节洗脱液pH、静置沉淀、离心,获得鼠李糖脂产物。2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤1)的发酵液在80~100℃下,加热处理20~60min;在8,000g~10,000g条件下,离心除去菌体和变性蛋白等不溶物。3.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2)中加入壳聚糖至终浓度为5~20g/L,在30~40℃下,絮凝沉降1~2h,然后弃掉上层液相。4.按照权利要求1或3所述的方法,其特征在于:选择脱乙酰度≥90%的壳聚糖。5.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤3)中,对于每5-15克沉淀物,用20~50ml蒸馏水洗涤沉淀物,此洗涤过程共进行1-3次;用20~50ml浓度为1~5g/L的NaHC...

【专利技术属性】
技术研发人员:赵峰张颖史荣久韩斯琴
申请(专利权)人:中国科学院沈阳应用生态研究所
类型:发明
国别省市:辽宁,21

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