一种多荧光单元复合分子的合成方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种多荧光单元复合分子的合成方法及其应用，属于生物检测领域。本发明专利技术选取异硫氰根罗丹明和异硫氰根荧光素作为原料，通过氨基化的反应，为了控制多位点的竞争，控制物质的投料比，采取柱分离的方法选择所需产品，然后分别用己炔酸、叠氮丁酸与分离得到的产品反应，得到炔基取代的产物和叠氮基取代的产物，继而在Cu+催化下，在室温通过Click chemistry成环得到多荧光单元的复合分子，实现荧光分子的定量偶联。本发明专利技术的合成方法具有操作简单、高效等优点，所得到的多荧光单元复合分子应用比率荧光传感器中可解决传感器批次间标准曲线不一致的问题。

Synthesis method and application of a composite molecule with multiple fluorescent units

The invention discloses a synthetic method and application of a multi fluorescent unit composite molecule, belonging to the field of biological detection. In this invention, isothiocyanate Luo Danming and isothiocyanogen fluorescein were selected as raw materials. Through the amination reaction, in order to control the competition of the multiposition points and control the feeding ratio of the material, the required products were selected by column separation method. Then the alkyne acid and azido butyric acid were used to react with the separated products to obtain the alkynyl substitutions. Under the catalysis of Cu+, the products of the azide substituent and the products of azide substituent are synthesized by the Click chemistry ring at room temperature to obtain the complex molecules of the multi fluorescence unit, so as to realize the quantitative coupling of the fluorescent molecules. The synthesis method of the invention has the advantages of simple operation and high efficiency. The obtained multi fluorescence unit composite molecular application ratio fluorescence sensor can solve the problem of the inconsistent standard curve between the batch of sensor batches.

【技术实现步骤摘要】
一种多荧光单元复合分子的合成方法及其应用
本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及一种多荧光单元复合分子的合成方法及其应用。
技术介绍
在生物体中，pH扮演了很重要的角色，而对于机体中各个器官、组织的微环境来说，精确测定pH显得尤为重要，其直接影响了组织器官的正常活动。随着生物学医学的发展，已经制备了用于测定生物体内pH的比率荧光传感器。通常的荧光传感器是用单一的荧光分子pH敏感型(Oregon488，Fluorescein)和pH惰性型(Alexa633，RhodamineB)，在荧光传感器的标准曲线测定时，每批次传感器都需要耗费大量精力来标定标准曲线，这极大的降低了工作效率。RichardP.Haugland在HandbookofFluorescentProbesandReseachProducts一书中列举了大量荧光分子，但没有涉及将两个荧光分子(敏感荧光分子和参比荧光分子)偶联在一起的方法。为了解决荧光组分之间的比例问题和可重复性问题，我们设计合成了一种分子，这种分子同时包括pH敏感单元和pH惰性单元。比率荧光法荧光纳米传感器由于涉及到两个(指示和参比)或者多个荧光(两个及以上指示荧光和一个参比荧光)单元体系，很难精确固定纳米颗粒上荧光单元之间的比例，导致批次间纳米传感器间性能不稳定，亦即标准曲线批次间重复性差，造成传感器性能的不可控。虽然复杂的生物介质、纳米材料本身结构的差异、材料表面电荷等也会造成标准曲线的变化，但是在固定上述条件时，荧光传感器性能的差异主要是由指示和参比荧光分子比例变化造成的。如果仅侧重纳米传感器概念性的开发和研究，制备一次样品即可满足所有初步探索性实验要求，这样就不涉及批次间纳米传感器性能无法重现带来的困扰。如果设计一种单一荧光指示分子，该分子由两个荧光单元(A，B)组成，在不同待测物浓度下两个荧光单元的固有的荧光波长下荧光强度(IA，IB)发生变化，通过两种荧光单元的荧光强度比值(IA/IB)随待测物浓度变化实现对待测物的定量检测，从而可解决传感器批次间标准曲线不一致问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决传感器批次间标准曲线不一致的问题，提供一种固定结构多荧光组分复合分子，即一种多荧光单元复合分子；本专利技术的目的还在于提供所述多荧光单元复合分子的合成方法及应用。本专利技术选取异硫氰根罗丹明和异硫氰根荧光素作为原料，采用Clickchemistry、控制反应条件等手段实现商用多荧光分子按照固定分子结构偶联，并保证偶联后的复合分子中多种荧光组分之间比例固定，获得高效制备多荧光单元复合物的方法。进而开辟一种将多种商业荧光小分子偶联在一起的通用、高效方法，开发出制备批次间性能稳定(标准曲线重复性好)传感器的方法，尤其对系统长期使用纳米传感器作为研究工具时提供了极大的便利。本专利技术的目的通过下述技术方法实现：本专利技术选取异硫氰根罗丹明和异硫氰根荧光素作为原料，通过氨基化的反应，为了控制多位点的竞争，控制物质的投料比，采取柱分离的方法选择所需产品，然后分别用己炔酸、叠氮丁酸与分离得到的产品反应，得到炔基取代的产物和叠氮基取代的产物，继而在Cu+催化下，在室温通过Clickchemistry成环得到多荧光单元的复合分子。一种多荧光单元复合分子，其结构如下所示：一种多荧光单元复合分子的合成方法，包括如下步骤：(1)以异硫氰根荧光素为原料，选择乙二胺进行氨基化反应，反应混合物通过柱层析分离，得到化合物①。作为优选项，所述步骤(1)中氨基化反应的条件为：20-30℃避光搅拌18-24h。作为优选项，所述步骤(1)中柱层析分离所用洗脱剂为二氯甲烷:乙醇＝1-2:1(V/V)的混合溶液；进一步优选的，二氯甲烷:乙醇＝1:1。(2)化合物①与叠氮丁酸进行取代反应，反应混合物通过柱层析进行梯度洗脱，得到化合物②。作为优选项，所述步骤(2)中用水:乙醇＝20-100:1(V/V)的混合溶液溶解化合物①；进一步优选的，水:乙醇＝60:1。作为优选项，所述步骤(2)中叠氮丁酸溶解在水中，先加入EDC活化0.5-2h后，再加入NHS活化0.5-2h；作为优选项，所述步骤(2)中取代反应的条件为：20-30℃避光搅拌18-24h；作为优选项，所述步骤(2)中梯度洗脱的洗脱剂分别为二氯甲烷:乙醇＝1-3:1(V/V)的混合溶液、二氯甲烷:甲醇＝1:2-4(V/V)的混合溶液，收集二氯甲烷:甲醇＝1:2-4的洗脱组分；进一步优选的，二氯甲烷:乙醇＝1:1，二氯甲烷:甲醇＝1:2。(3)以异硫氰根罗丹明为原料，选择乙二胺进行氨基化反应，反应混合物通过柱层析分离，得到化合物③。作为优选项，所述步骤(3)中氨基化反应的条件为：20-30℃避光搅拌18-24h；作为优选项，所述步骤(3)中柱层析分离所用洗脱剂为二氯甲烷:乙醇＝11-15:1(V/V)的混合溶液；进一步优选的，二氯甲烷:乙醇＝11:1。(4)化合物③与己炔酸进行取代反应，反应混合物通过柱层析分离，得到化合物④。作为优选项，所述步骤(4)中用水:乙醇＝20-60:1(V/V)的混合溶液溶解化合物③；进一步优选的，水:乙醇＝40:1。作为优选项，所述步骤(4)中己炔酸溶解在水中，先加入EDC活化0.5-2h后，再加入NHS活化0.5-2h；作为优选项，所述步骤(4)中取代反应的条件为：20-30℃避光搅拌18-24h；作为优选项，所述步骤(4)中柱层析分离所用洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝8-10:1(V/V)的混合溶液；进一步优选的二氯甲烷:甲醇＝8:1。(5)化合物②和化合物④通过点击化学反应(Clickchemistry)成环得到化合物⑤。作为优选项，所述步骤(5)中化合物②和化合物④的摩尔比为1:1；作为优选项，所述步骤(5)中溶解化合物②和化合物④的溶剂为水:叔丁醇:乙醇＝4:1:1(V/V)；作为优选项，所述步骤(5)中Cu2+作为催化剂前体；作为优选项，所述步骤(5)中抗坏血酸钠作为还原剂，将Cu2+还原为Cu+作为催化剂；上述步骤(1)、(3)中氨基化反应所选择乙二胺还可替换为三(2-氨基乙基)胺。上述多荧光单元复合分子在比率荧光传感器中的应用。本专利技术的多荧光单元复合分子，与单荧光分子相比，克服了单荧光分子和多位点活性化合物存在的竞争反应，实现多荧光分子的高效偶联，并保证偶联后的复合分子中多种荧光组分之间比例固定。进而开辟出一种将多种商业荧光小分子偶联在一起的通用、高效方法，开发出制备批次间性能稳定(标准曲线重复性好)传感器的方法，尤其对系统长期使用纳米传感器作为研究工具时提供了极大的便利。一种多荧光单元复合分子的合成方法，为将两种荧光分子用异硫氰根修饰后，按照上述方法进行氨基化反应、取代反应和点击化学反应合成多荧光单元复合分子。本专利技术的优点和有益效果为：(1)利用乙二胺进行氨基化，并通过柱层析的方法将其分离，从而得到所需的产物。(2)利用叠氮丁酸和己炔酸分别对单荧光素-乙二胺和单罗丹明-乙二胺进行修饰，从而为点击化学反应做准备。(3)利用点击化学的方法巧妙的将两个商用多荧光分子按照固定分子结构偶联，确保了荧光分子的固定结构和固定比率。(4)将合成出的多荧光单元复合分子应用到比率荧光传感器中，可制备出批次间性能稳定(标准曲线重复性好)传感器。具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多荧光单元复合分子，其特征在于：结构如下所示：

【技术特征摘要】
1.一种多荧光单元复合分子，其特征在于：结构如下所示：2.权利要求1所述的多荧光单元复合分子的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以异硫氰根荧光素为原料，选择乙二胺进行氨基化反应，反应混合物通过柱层析分离，得到化合物①；(2)化合物①与叠氮丁酸进行取代反应，反应混合物通过柱层析进行梯度洗脱，得到化合物②；(3)以异硫氰根罗丹明为原料，选择乙二胺进行氨基化反应，反应混合物通过柱层析分离，得到化合物③；(4)化合物③与己炔酸进行取代反应，反应混合物通过柱层析分离，得到化合物④；(5)化合物②和化合物④通过点击化学反应(Clickchemistry)成环得到化合物⑤3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(1)中，氨基化反应的条件为：20-30℃避光搅拌18-24h；柱层析分离所用洗脱剂为二氯甲烷:乙醇＝1-2:1的混合溶液。4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，用水:乙醇＝20-100:1的混合溶液溶解化合物①；叠氮丁酸溶解在水中，先加入EDC活化0.5-2h后，再加入NHS活化0.5-2h；取代反应的条件为：20-30℃避光搅拌18-24h；梯度洗脱的洗脱剂分别为二氯甲烷:乙醇＝1-3:1的混合溶液、二氯甲烷:甲醇＝1:2-4的混合溶液，收集二氯甲烷:甲醇＝...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宏浩，秦汤，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42