一种类弹性蛋白-抗EGFR纳米抗体-iRGD的双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的制法和用途制造技术

本发明专利技术公开了一种基于类弹性蛋白的双靶向融合蛋白，即类弹性蛋白‑抗EGFR纳米抗体‑iRGD的双靶向融合蛋白，是基于基因重组技术构建含ELP、抗EGFR纳米抗体、iRGD基因的重组质粒，并在大肠杆菌中表达纯化的双靶向融合蛋白。它可以偶联药物阿霉素，形成ELP‑抗EGFR‑iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体。ELP‑抗EGFR‑iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的水合粒径在5nm左右，主要以分子状态存在，显示了良好的阿霉素缓释功能和对肿瘤细胞的靶向功能。本发明专利技术公开了ELP‑抗EGFR‑iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的制法。

Preparation and application of a dual targeting fusion protein adriamycin couplet with elastin anti EGFR -iRGD antibody

The invention discloses a double targeting fusion protein based on the elastin like protein, that is the double target fusion protein of the anti EGFR nano antibody iRGD, which is a recombinant plasmid containing ELP, anti EGFR nanoscale antibody and iRGD gene based on the gene recombination technology, and expresses the purified double target fusion protein in Escherichia coli. It can be conjugated with doxorubicin, forming ELP EGFR iRGD double targeting fusion protein adriamycin couplet. The hydrated particle size of the anti EGFR iRGD dual target fusion protein adriamycin is around 5nm, mainly in the molecular state, showing the good release function of adriamycin and the targeting function of the tumor cells. The invention discloses a method for preparing ELP EGFR anti doxorubicin couplet of anti iRGD fusion protein.

【技术实现步骤摘要】
一种类弹性蛋白-抗EGFR纳米抗体-iRGD的双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的制法和用途
本专利技术涉及医药
，特别是涉及用于肿瘤治疗的酸敏感的双靶向抗体药物偶联体的制备。
技术介绍
近年来，我国患癌人数呈现不断增加的趋势，癌症的多样化，恶性化以及难治愈性都对治疗技术的发展提出了很高的要求。目前最有效的肿瘤治疗方法仍然是化疗，但化疗药物一般是小分子药物，在体内循环时间较短。要想获得良好的治疗效果，常常需要多次化疗，伴随着较大的毒副作用。因此化疗对患者的伤害性比较大。其中，阿霉素(DOX)是一种广谱的抗肿瘤药物。它具有强烈的细胞毒性作用，作用机理主要是通过嵌入DNA而限制核酸的合成。它的分子量只有543.52Da，能被肾脏迅速的代谢，在体内循环时间很短，因而在肿瘤的富集量就比较低。要想达到良好的肿瘤治疗效果就必须加大注射剂量，而加大剂量就伴随着毒副作用的增加。阿霉素分子中含有酮键和氨基，都可以被用来进一步修饰。将阿霉素负载在纳米载体上，通过纳米载体的增强渗透滞留(EPR)效应来增加阿霉素在肿瘤的富集量，降低阿霉素对其他器官的毒副作用是一种常用的方法，但纳米载体容易被肝摄取，造成比较大的肝毒性。随着科学技术的进步和医疗手段的不断发展，免疫疗法也取得了很大的进步。但是免疫疗法的适应性比较差，不如化疗药物多数具备广谱性。同时，免疫药物的制备比较繁琐，成本比较高，所以价格也比较高。不能适用于大多数人群。随着基因工程和免疫研究的发展，研究人员发现大部分的恶性肿瘤都会过表达表皮生长因子受体(EGFR)。EGFR是一种酪氨酸蛋白激酶受体，分子量在170kDa左右。现在已上市的EGFR抗体有西妥昔单抗、帕尼单抗等。虽然单克隆抗体对抗原的结合能力比较强，在肿瘤治疗方面也取得了一定的成功。但是其具大的尺寸限制了抗体在肿瘤中的渗透和获得更佳的治疗效果。同时复杂的制备过程和后期的人源化改造步骤繁琐，成本较高。纳米抗体也就是单域抗体，是目前为止自然存在的最小的抗原结合片段。纳米抗体又称为单域抗体是骆驼源的重链可变区，尺寸较小，在纳米级，分子量大约在15kDa左右，渗透性较完整抗体好。纳米抗体不含Fc段，也就减少了免疫反应，不需要后期的人源化改造步骤。同时纳米抗体可以很容易的通过基因重组技术在大肠杆菌中进行大量表达，进一步降低成本。肿瘤细胞因为其生长迅速，营养物质需求过大常会导致一些细胞表面的受体的过表达，比如整合素、铸铁蛋白受体等。抗体以及靶向细胞表面受体的活性蛋白分子都是用于肿瘤靶向治疗的良好选择。本专利技术中，我们制备的双靶向融合蛋白药物偶联体是将不同特异性的蛋白融合在一起，再与化疗药物偶联的方法，其优势包括⑴改善小分子化疗药物的水溶性和稳定性，提高体内循环时间；⑵降低脱靶行为的发生；⑶将药物更多的输送到肿瘤部位，提高药物在肿瘤的富集量；⑷降低化疗药物的毒副作用，提高药物的注射剂量，提高抗肿瘤治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于类弹性蛋白的对EGFR和整合素双靶向的融合蛋白，其中靶向基团分别采用抗EGFR的纳米抗体和iRGD短肽。本专利技术所述的类弹性蛋白，是由48个VPGXG五肽构成的重复序列，其中X为K：V：F＝1：2：1(V、P、G、K、F均是氨基酸的缩写)。本专利技术的另一目的在于提供一种基于类弹性蛋白含抗EGFR纳米抗体和iRGD的双靶向融合蛋白与阿霉素的偶联体及其制备方法。本专利技术的技术方案如下：一种类弹性蛋白—抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，是通过分子生物学手段和基因重组技术构建质粒并在大肠杆菌中表达得到的，通过点击化学将药物阿霉素偶联形成ELP-抗EGFR-iRGD-DOX双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，其具有如下结构：一种制备上述类弹性蛋白—抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的方法，它包括如下步骤：步骤1、类弹性蛋白基因的构建：采用递归定向连接的方法将基因合成的类弹性蛋白的单体基因连接在一起构建目标大小的基因序列，将含类弹性蛋白单体基因的pUC19质粒分别用BglI酶切和PflM、BglI双酶切，分别用PCR纯化试剂盒进行纯化，用T4连接酶将单双酶切产物按3:7的比例在16℃下连接过夜，取全部连接液热击到TOP10感受态中，涂布X-gal氨苄平板，过夜培养，进行蓝白筛选，挑取阳性克隆的白色菌落于5mL摇管中37℃，210rpm培养12h，使用质粒提取试剂盒提取质粒，进行核酸电泳验证和DNA测序验证，重复上述单双酶切步骤，直到得到理想的序列长度，即具有12个重复单体基因的序列；将基因合成的含类弹性蛋白基因的质粒用BglI和PflM双酶切，酶切体系为20μL：BglI酶1μL、PflM酶2μL、酶切缓冲液5μL和质粒43μL；酶切体系保持37℃下三小时，然后将反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化得到双酶切的类弹性蛋白基因片段；步骤2、含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒的构建利用合成的含HindIII和EcoRI酶切位点的引物对P1和P2对含抗EGFR-iRGD基因的pET-28a质粒进行PCR反应，扩增得到抗EGFR-iRGD基因；PCR体系为50μL，其中：ddH2O22μL、模板1μL、引物P11μL、引物P21μL和Extaq酶25μL，)PCR反应条件是:95℃5min、(95℃30s；55℃30s；72℃1min)*30个循环和72℃5min，4℃保持，将反应完的混合物用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到抗EGFR-iRGD基因片段，将得到的抗EGFR-iRGD基因和空白pET-25b的质粒分别用HindIII和EcoRI酶进行双酶切，然后用PCR纯化试剂盒分别纯化，接着在T4连接酶的作用下在16℃下过夜连接，即得到含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒；步骤3、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的构建和扩增首先将含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒进行SfiI单酶切，使用PCR纯化试剂盒进行纯化；接着将5μLBglI和PflM双酶切的类弹性蛋白基因与5μLSfiI单酶切的含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒在T4连接酶的作用下于16℃过夜连接；将10μL的连接液全部与TOP10感受态细胞共混进行热击转化，涂布于氨苄抗性的TB平板上，过夜生长；挑取阳性克隆单菌落于5mL氨苄抗性的TB摇管中，37℃，210rpm培养12h；使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，即得到含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的pET-25b质粒；步骤4、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白的表达将含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白基因的质粒通过热击的方法转入表达菌株BL21中，涂布于氨苄抗性的TB平板上，37℃过夜培养后挑取阳性克隆转入5mL摇管中37℃，210rpm继续培养8-12小时，按1％的接种量将摇管中培养过夜的菌液接种到200mL摇瓶中，添加氨苄抗生素的条件下培养至OD600＝0.6，加入终浓度是1mM的IPTG，37℃，210rpm诱导表达4h，8000g，4℃离心收菌；步骤5、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白的纯化将步骤4得到的沉菌重悬在10mL结合缓冲液(500mM氯化钠，20mMPBS,pH＝7.4，5mM咪唑)，在冰水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种类弹性蛋白—抗EGFR‑iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，其特征是：它是通过分子生物学手段和基因重组技术构建质粒并在大肠杆菌中表达得到的，通过点击化学将药物阿霉素偶联形成ELP‑anti‑EGFR‑iRGD‑DOX双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，其具有如下结构：

【技术特征摘要】
1.一种类弹性蛋白—抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，其特征是：它是通过分子生物学手段和基因重组技术构建质粒并在大肠杆菌中表达得到的，通过点击化学将药物阿霉素偶联形成ELP-anti-EGFR-iRGD-DOX双靶向融合蛋白阿霉素偶联体，其具有如下结构：2.一种制备权利要求1所述类弹性蛋白—抗EGFR-iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的方法，其特征是它包括如下步骤：步骤1、类弹性蛋白基因的构建：采用递归定向连接的方法将基因合成的类弹性蛋白的单体基因连接在一起构建目标大小的基因序列，将含类弹性蛋白单体基因的pUC19质粒分别用BglI酶切和PflM、BglI双酶切，分别用PCR纯化试剂盒进行纯化，用T4连接酶将单双酶切产物按3:7的比例在16℃下连接过夜，取全部连接液热击到TOP10感受态中，涂布X-gal氨苄平板，过夜培养，进行蓝白筛选，挑取阳性克隆的白色菌落于5mL摇管中37℃，210rpm培养12h，使用质粒提取试剂盒提取质粒，进行核酸电泳验证和DNA测序验证，重复上述单双酶切步骤，直到得到理想的序列长度，即具有12个重复单体基因的序列；将基因合成的含类弹性蛋白基因的质粒用BglI和PflM双酶切，酶切体系为20μL：BglI酶1μL、PflM酶2μL、酶切缓冲液5μL和质粒43μL；酶切体系保持37℃下三小时，然后将反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化得到双酶切的类弹性蛋白基因片段；步骤2、含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒的构建利用合成的含HindIII和EcoRI酶切位点的引物对P1和P2对含抗EGFR-iRGD基因的pET-28a质粒进行PCR反应，扩增得到抗EGFR-iRGD基因；PCR体系为50μL，其中：ddH2O22μL、模板1μL、P11μL、P21μL和Extaq酶25μL，PCR反应条件是:95℃5min、(95℃30s；55℃30s；72℃1min)*30个循环和72℃5min，4℃保持，将反应完的混合物用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到抗EGFR-iRGD基因片段，将得到的抗EGFR-iRGD基因和空白pET-25b的质粒分别用HindIII和EcoRI酶进行双酶切，然后用PCR纯化试剂盒分别纯化，接着在T4连接酶的作用下在16℃下过夜连接，即得到含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒；步骤3、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的构建和扩增首先将含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒进行SfiI单酶切，使用PCR纯化试剂盒进行纯化；接着将5μLBglI和PflM双酶切的类弹性蛋白基因与5μLSfiI单酶切的含抗EGFR-iRGD基因的pET-25b质粒在T4连接酶的作用下于16℃过夜连接；将10μL的连接液全部与TOP10感受态细胞共混进行热击转化，涂布于氨苄抗性的TB平板上，过夜生长；挑取阳性克隆单菌落于5mL氨苄抗性的TB摇管中，37℃，210rpm培养12h；使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，即得到含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD重组基因的pET-25b质粒；步骤4、类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白的表达将含类弹性蛋白抗EGFR-iRGD融合蛋白基因的质粒通过热击的方法转入表达菌株BL21中，涂布于氨苄抗性...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋锡群，陈伟芝，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32