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一种植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法技术

技术编号:18250404 阅读:114 留言:0更新日期:2018-06-20 04:29
本发明专利技术公开了一种植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法,其包括,甘露糖基转移酶的原核表达:分别在大肠杆菌中表达酵母来源的Alg1ΔTM、Trx‑Alg2、Alg11ΔTM、Dpm1、M‑Alg3、M‑Alg9以及Alg12;甘露糖基转移酶的纯化;制备甘露糖基转移酶膜成份;供体底物PP‑Man的合成;PPGn2‑Man1、PPGn2‑Man3、PPGn2‑Man5、PPGn2‑Man6、PPGn2‑Man7、PPGn2‑Man8、PPGn2‑Man9和PPGn2‑Man4的合成。本发明专利技术原核表达纯化了酵母来源的Alg1ΔTM、Trx‑Alg2、Alg11ΔTM、Dpm1、M‑Alg3、M‑Alg9以及Alg12甘露糖基转移酶,并在体外成功制备了PPGn2‑Man1、PPGn2‑Man3、PPGn2‑Man5、PPGn2‑Man6、PPGn2‑Man7、PPGn2‑Man8、PPGn2‑Man9和PPGn2‑Man4高甘露糖型寡糖,解决了多次跨膜真核蛋白原核表达极易降解、真核膜蛋白表达纯化困难的技术问题,甘露糖基转移酶的高效性和立体选择性克服了有机合成的困难,推动糖化学与糖生物学的发展。

Preparation of a high mannose oligosaccharide linked to an alkanol

The present invention discloses a preparation method of a high mannose type oligosaccharide oligosaccharide, which includes the prokaryotic expression of mannose based transferase: expression of yeast derived Alg1 Delta TM, Trx Alg2, Alg11 Delta TM, Dpm1, M Alg3, M Alg9 and Alg12; mannose transferase purification; preparation of manna, respectively in Escherichia coli The composition of the glycosyltransferase membrane; the synthesis of the donor substrate PP Man; the synthesis of PPGn2 Man1, PPGn2 Man3, PPGn2 Man5, PPGn2 Man6, PPGn2 Man7. The original expression and purification of yeast derived Alg1 Delta TM, Trx Alg2, Alg11 Delta TM, Dpm1, M Alg3, M Alg9 Alg9, and Alg12 mannose based transferase were successfully prepared in vitro. Oligosaccharides have solved the technical problems of many transmembrane eukaryotic expression of eukaryotic proteins, which are easy to degrade, and the expression and purification of real ribonucleic proteins are difficult. The high efficiency and stereoselectivity of mannose transferase overcame the difficulty of organic synthesis, and promoted the development of sugar chemistry and sugar biology.

【技术实现步骤摘要】
一种植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法
本专利技术属于分子生物学及生物化学
,具体涉及一种植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法。
技术介绍
糖基化是对蛋白质或脂质进行糖(寡糖)的修饰,形成糖复合物的过程,也是真核细胞翻译后修饰的主要形式之一。蛋白质上的N-糖基化修饰直接影响了蛋白的结构和功能,具有重要的生理意义。高甘露糖型寡糖作为N-糖基化修饰之中的一大类,目前广泛用于生物学研究,如糖芯片,糖疫苗及蛋白质量控制等。目前高甘露糖型寡糖的制备主要通过化学方法和从植物或者酵母中提取,然而两种方法都是耗时耗力,副产物多且产率极低。化学酶法作为化学合成的一种替代方法,具有高度立体异构选择且极度高效的转化率的优势,目前广泛应用于多糖合成。然而目前还未曾报道过化学酶法合成高甘露糖型寡糖,主要原因是在于催化合成此结构的一系列酶为内质网驻留酶,均为真核膜蛋白,表达纯化极为困难;另一原因在于酶的底物为脂质磷酸连接的糖,不易得到。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊,而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。鉴于上述的技术缺陷,提出了本专利技术。因此,本专利技术克服现有技术中存在的不足,提供一种植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法。为解决上述技术问题,本专利技术提供了如下技术方案:一种植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法,其包括,甘露糖基转移酶的原核表达:分别在大肠杆菌中表达酵母来源的Alg1ΔTM、Trx-Alg2、Alg11ΔTM、Dpm1、M-Alg3、M-Alg9以及Alg12,所述Alg1ΔTM为截掉N-端跨膜结构域的甘露糖基转移酶Alg1,所述Trx-Alg2为融合了Trx标签的甘露糖基转移酶Alg2,所述Alg11ΔTM为截掉N-端跨膜结构域的甘露糖基转移酶Alg1,所述Dpm1为长萜基磷酸-甘露糖转移酶多肽1,所述M-Alg3为融合了Mistic标签的甘露糖基转移酶Alg3,所述M-Alg9为融合了Mistic标签的甘露糖基转移酶Alg9,所述Alg12为甘露糖基转移酶Alg12;甘露糖基转移酶的纯化:将经过原核表达的所述Alg1ΔTM、Trx-Alg2、Alg11ΔTM及Dpm1分别进行纯化;制备甘露糖基转移酶膜成份:将经过原核表达的所述M-Alg3、M-Alg9及Alg12分别制备膜成份;供体底物PP-Man的合成:将经过纯化的所述Dpm1蛋白催化phytanyl-phosphate和供体GDP-Man,合成所述PP-Man;PPGn2-Man1、PPGn2-Man3及PPGn2-Man5的合成:将PPGn2与所述GDP-Man在所述甘露糖基转移酶Alg1ΔTM、Trx-Alg2及Alg11ΔTM催化下,依次得到所述PPGn2-Man1、PPGn2-Man3及PPGn2-Man5;PPGn2-Man6、PPGn2-Man7、PPGn2-Man8及PPGn2-Man9的合成:向合成所述PPGn2-Man5的反应体系中加入PP-Man,在所述甘露糖基转移酶M-Alg3、M-Alg9及M-Alg9催化下,依次得到PPGn2-Man6、PPGn2-Man7、PPGn2-Man8及PPGn2-Man9;不常见结构的PPGn2-Man4、PPGn2-Man5、PPGn2-Man6及PPGn2-Man7的合成:向合成所述PPGn2-Man3的反应体系中加入PP-Man,在所述甘露糖基转移酶M-Alg3、M-Alg9及M-Alg9催化下,依次得到不常见结构的PPGn2-Man4、PPGn2-Man5、PPGn2-Man6及PPGn2-Man7。作为本专利技术所述植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法的优选方案,所述甘露糖基转移酶的原核表达,其中,所述大肠杆菌为ROSETTA原核表达宿主菌。作为本专利技术所述植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法的优选方案,其中,所述原核表达,其载体分别为:pET28a-Alg1△TM、pET32a-Trx-Alg2、pET28a-Alg11△TM、pET28a-Dpm1、pET28a-M-Alg3、pET28a-M-Alg9及pET28a-Alg12。作为本专利技术所述植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法的优选方案,所述甘露糖基转移酶的纯化,其中,将原核表达了所述Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1的重组大肠杆菌分别超声破碎后,分别离心制备Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1膜成分,并将所述Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1膜成分分别溶于1%TritonX-100缓冲液得到Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1膜蛋白;将原核表达了所述Alg11△TM的重组大肠杆菌超声破碎后离心得到Alg11△TM上清蛋白;将所述Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1膜蛋白分别经镍离子亲和层析纯化,将所述Alg11△TM上清蛋白经镍离子亲和层析纯化。作为本专利技术所述植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法的优选方案,所述分别离心制备Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1膜成分,其中,将所述原核表达了Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1的重组大肠杆菌分别超声破碎后,于4000r/min离心20min,弃沉淀,收集上清,15000r/min高速离心90min,弃上清;所述离心得到Alg11△TM上清蛋白,离心速度为15000r/min,时间为90min。作为本专利技术所述植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法的优选方案,所述制备甘露糖基转移酶膜成份,其中,将原核表达了所述M-Alg3、M-Alg9及Alg12的重组大肠杆菌分别超声破碎后,4000r/min离心20min,弃沉淀,收集上清,超速离心,弃上清,得到大肠杆菌细胞膜成分,所述超速离心,速度为100000r/min,时间为60min。作为本专利技术所述植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法的优选方案,所述供体底物PP-Man的合成,其中,将经过纯化的所述Dpm1蛋白催化phytanyl-phosphate和供体GDP-Man,合成所述PP-Man,所述PP-Man的反应体系组成为:1mM/μLTris/HClpH7.5、0.2mM/μLMgCl2、1%NP-40、0.4mM/μLphytanyl-phosphate、1mM/μLGDP-Man、2mg/mLDpm1,反应温度为30℃,时间为10h。作为本专利技术所述植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法的优选方案,中,所述PPGn2-Man1、PPGn2-Man3及PPGn2-Man5的合成,其反应体系为:14mM/60μLMESpH6.0、4mM/60μLpotassiumcitrate、10mM/60μLMgCl2、10mM/60μLMnCl2、0.05%NP-40、50M/60μLPPGn2、1M/60μLsucrose、10μLPE脂质体、2mM/60μLGDP-Man,向其反应体系中依次加入0.5g/mLAlg1ΔTM、150μg/mLTrx-Alg2、50μg/mLAlg11ΔTM,反应温度为30℃,时间为12h,依次得到PPGn2本文档来自技高网...
一种植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法

【技术保护点】
1.一种植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法,其特征在于:包括,甘露糖基转移酶的原核表达:分别在大肠杆菌中表达酵母来源的Alg1ΔTM、Trx‑Alg2、Alg11ΔTM、Dpm1、M‑Alg3、M‑Alg9以及Alg12,所述Alg1ΔTM为截掉N‑端跨膜结构域的甘露糖基转移酶Alg1,所述Trx‑Alg2为融合了Trx标签的甘露糖基转移酶Alg2,所述Alg11ΔTM为截掉N‑端跨膜结构域的甘露糖基转移酶Alg1,所述Dpm1为长萜基磷酸‑甘露糖转移酶多肽1,所述M‑Alg3为融合了Mistic标签的甘露糖基转移酶Alg3,所述M‑Alg9为融合了Mistic标签的甘露糖基转移酶Alg9,所述Alg12为甘露糖基转移酶Alg12;甘露糖基转移酶的纯化:将经过原核表达的所述Alg1ΔTM、Trx‑Alg2、Alg11ΔTM及Dpm1分别进行纯化;制备甘露糖基转移酶膜成份:将经过原核表达的所述M‑Alg3、M‑Alg9及Alg12分别制备膜成份;供体底物PP‑Man的合成:将经过纯化的所述Dpm1蛋白催化phytanyl‑phosphate和供体GDP‑Man,合成所述PP‑Man;PPGn2‑Man1、PPGn2‑Man3及PPGn2‑Man5的合成:将PPGn2与所述GDP‑Man在所述甘露糖基转移酶Alg1ΔTM、Trx‑Alg2及Alg11ΔTM催化下,依次得到所述PPGn2‑Man1、PPGn2‑Man3及PPGn2‑Man5;PPGn2‑Man6、PPGn2‑Man7、PPGn2‑Man8及PPGn2‑Man9的合成:向合成所述PPGn2‑Man5的反应体系中加入PP‑Man,在所述甘露糖基转移酶M‑Alg3、M‑Alg9及M‑Alg9催化下,依次得到PPGn2‑Man6、PPGn2‑Man7、PPGn2‑Man8及PPGn2‑Man9;不常见结构的PPGn2‑Man4、PPGn2‑Man5、PPGn2‑Man6及PPGn2‑Man7的合成:向合成所述PPGn2‑Man3的反应体系中加入PP‑Man,在所述甘露糖基转移酶M‑Alg3、M‑Alg9及M‑Alg9催化下,依次得到不常见结构的PPGn2‑Man4、PPGn2‑Man5、PPGn2‑Man6及PPGn2‑Man7。...

【技术特征摘要】
1.一种植烷醇连接的高甘露糖型寡糖的制备方法,其特征在于:包括,甘露糖基转移酶的原核表达:分别在大肠杆菌中表达酵母来源的Alg1ΔTM、Trx-Alg2、Alg11ΔTM、Dpm1、M-Alg3、M-Alg9以及Alg12,所述Alg1ΔTM为截掉N-端跨膜结构域的甘露糖基转移酶Alg1,所述Trx-Alg2为融合了Trx标签的甘露糖基转移酶Alg2,所述Alg11ΔTM为截掉N-端跨膜结构域的甘露糖基转移酶Alg1,所述Dpm1为长萜基磷酸-甘露糖转移酶多肽1,所述M-Alg3为融合了Mistic标签的甘露糖基转移酶Alg3,所述M-Alg9为融合了Mistic标签的甘露糖基转移酶Alg9,所述Alg12为甘露糖基转移酶Alg12;甘露糖基转移酶的纯化:将经过原核表达的所述Alg1ΔTM、Trx-Alg2、Alg11ΔTM及Dpm1分别进行纯化;制备甘露糖基转移酶膜成份:将经过原核表达的所述M-Alg3、M-Alg9及Alg12分别制备膜成份;供体底物PP-Man的合成:将经过纯化的所述Dpm1蛋白催化phytanyl-phosphate和供体GDP-Man,合成所述PP-Man;PPGn2-Man1、PPGn2-Man3及PPGn2-Man5的合成:将PPGn2与所述GDP-Man在所述甘露糖基转移酶Alg1ΔTM、Trx-Alg2及Alg11ΔTM催化下,依次得到所述PPGn2-Man1、PPGn2-Man3及PPGn2-Man5;PPGn2-Man6、PPGn2-Man7、PPGn2-Man8及PPGn2-Man9的合成:向合成所述PPGn2-Man5的反应体系中加入PP-Man,在所述甘露糖基转移酶M-Alg3、M-Alg9及M-Alg9催化下,依次得到PPGn2-Man6、PPGn2-Man7、PPGn2-Man8及PPGn2-Man9;不常见结构的PPGn2-Man4、PPGn2-Man5、PPGn2-Man6及PPGn2-Man7的合成:向合成所述PPGn2-Man3的反应体系中加入PP-Man,在所述甘露糖基转移酶M-Alg3、M-Alg9及M-Alg9催化下,依次得到不常见结构的PPGn2-Man4、PPGn2-Man5、PPGn2-Man6及PPGn2-Man7。2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述甘露糖基转移酶的原核表达,其中,所述大肠杆菌为ROSETTA原核表达宿主菌。3.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:所述原核表达,其载体分别为:pET28a-Alg1△TM、pET32a-Trx-Alg2、pET28a-Alg11△TM、pET28a-Dpm1、pET28a-M-Alg3、pET28a-M-Alg9及pET28a-Alg12。4.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:所述甘露糖基转移酶的纯化,其中,将原核表达了所述Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1的重组大肠杆菌分别超声破碎后,分别离心制备Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1膜成分,并将所述Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1膜成分分别溶于1%TritonX-100缓冲液得到Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1膜蛋白;将原核表达了所述Alg11△TM的重组大肠杆菌超声破碎后离心得到Alg11△TM上清蛋白;将所述Alg1△TM、Trx-Alg2及Dpm1膜蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员:高晓冬李盛陶王宁
申请(专利权)人:江南大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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