一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒，先从血清中提取总甲状腺激素，对血清中的总甲状腺激素进行SPTPP衍生化，然后再利用超高效液相色谱‑串联质谱(UPLC‑MS/MS)进行检测。与传统方法相比，本发明专利技术仅利用10μL血清样品，即可高效精准检测血清总甲状腺激素浓度，灵敏度极高、抗干扰能力强，可最大程度保证样品的有效回收与高重复性。 1

【技术实现步骤摘要】
一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒
本专利技术属于生物化学检测领域，涉及一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒，尤其涉及少量血清精准检测甲状腺激素T4、T3、rT3的测定方法及试剂盒。
技术介绍
甲状腺激素对人和动物的生长、发育、新陈代谢和神经发育等具有重要的作用。血清中甲状腺T3、T4、rT3的测定可提供甲状腺激素水平的重要信息，为甲状腺功能紊乱的病因诊断及毒性因子识别提供帮助。目前，免疫分析法被广泛应用在甲状腺激素T3、T4的测定，但该方法的特异性不强、方法灵敏性不高。此外，使用免疫分析方法检测怀孕女性血清的甲状腺激素T4和T3时，由于怀孕期间类固醇激素和甲状腺结合球蛋白的复杂变化，导致甲状腺激素水平检测错误。目前，已有研究者通过HPLC-MS/MS直接测定血清的甲状腺激素水平，该方法与免疫分析法相比，对甲状腺激素的鉴定的可信度与重现性均有所提高，但仍存在检出限较高，导致测定所需的血清量达500μL的缺点。
技术实现思路
为达到少量血清精准快速检测甲状腺激素水平的目的，本专利技术提供了一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒，先对从血清中提取的总甲状腺激素进行SPTPP衍生化，然后再利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)进行检测，采用少量(10μl)血清即可精准测定其中甲状腺激素T4、T3、rT3，该方法弥补了传统分析方法不稳定、重现性差的缺陷。该方法重现性好，血清使用量少，且用于测定微量血清中的总甲状腺激素含量时亦更加准确。本专利技术采取的技术方案为：一种测定血清中总甲状腺激素的方法，包括：首先提取待测血清中的总甲状腺激素，然后将总甲状腺激素提取液进行SPTPP((5-N-succinimidoxy-5-oxopentyl)-triphenylphosphoniumbromide)衍生化，再对SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测，完成对血清总甲状腺激素的测定。进一步地，所述总甲状腺激素包括结合态甲状腺激素和游离态甲状腺激素，通过沉淀待测血清中的甲状腺激素结合蛋白，即可释放出结合态甲状腺激素。进一步地，所述总甲状腺激素包括甲状腺激素T4、T3或者甲状腺激素T4、T3和rT3。通过以下方法提取待测血清中的总甲状腺激素：10-50μl待测血清加入等体积的甲醇内标溶液和1-5μl抗氧化剂，混匀置于-20-0℃环境下，15分钟后取出；大于8000g离心力，离心5-15分钟，取上清液即得总甲状腺激素提取液。优选地，所述抗氧化剂为柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液，混合水溶液中各物质浓度均为50g/L；所述甲醇内标溶液为甲状腺激素13C6-T4浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液。进一步地，所述SPTPP衍生化包括：向300μl衍生反应缓冲溶液中加入10-20μl总甲状腺激素提取液，加入50μl衍生试剂，密封涡旋混匀，40℃衍生化反应10分钟，反应结束后立刻将其(即前述衍生化反应的产物)置于冰上同时加入衍生反应终止溶液700μl终止反应。优选地，所述衍生试剂为10mMSPTPP的甲醇溶液；所述衍生反应缓冲溶液为0.1M的磷酸缓冲液(PBS、pH8.0)；所述衍生反应终止溶液为含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。进一步地，上述方法还包括进行UPLC-MS/MS检测前，将SPTPP衍生化产物用乙酸乙酯萃取，收集的萃取液用氮气吹干再用甲醇定容，用于UPLC-MS/MS检测。优选地，用1mL乙酸乙酯对SPTPP衍生化产物进行萃取1-3次，将上层乙酸乙酯收集后加入1mL水清洗乙酸乙酯萃取液，收集上层乙酸乙酯，微弱氮气吹至近干，加入500μl甲醇，涡旋混匀，用于UPLC-MS/MS检测。进一步地，上述UPLC-MS/MS检测的具体步骤为：取SPTPP衍生化产物和不同甲状腺激素不同浓度梯度的空白血清基质-SPTPP衍生混合标准曲线溶液，通过UPLC-MS/MS进行测定，依据内标法，以内标矫正的峰面积对其进行相应浓度线性回归分析，计算待测血清总甲状腺激素的浓度。优选地，通过以下方法配制不同甲状腺激素不同浓度梯度的空白血清基质-SPTPP衍生混合标准曲线溶液：(1)分别称取10mg的不同甲状腺激素，用甲醇定容至10mL，制得浓度均为1000μg/mL的标准储备液；(2)分别取步骤(1)中的各标准储备液，混合，配制不同甲状腺激素浓度均为10μg/mL的混合标准溶液；(3)取步骤(2)中的混合标准溶液，加入活性炭去除甲状腺激素的空白血清基质中，配制浓度梯度为0.250ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL和150ng/mL的工作溶液，分别进行SPTPP衍生化反应，获得不同甲状腺激素(T4、T3、rT3)不同浓度梯度的空白血清基质-SPTPP衍生混合标准曲线溶液。优选的，上述UPLC-MS/MS检测条件为：色谱柱为T3柱，柱长50mm；流动相梯度采用甲醇(A)和超纯水(B)，其梯度变化为0-7min，10％A；7-12min，10％-90％A；12-13min，90％A；13-13.1min，90％-10％A；13.1-16min，10％A；流动相流速为0.3mL/min；柱温为40℃，进样量为2-10μl；质谱的离子源为：ESI源；数据扫描方式：正离子模式；测定方式：选择反应监测方式(MRM)；质谱的脱溶剂气温度为500℃；毛细管电压为3-3.2kV；脱溶剂气流量为900L/Hr；锥孔电压为34V；源温度为150℃。本专利技术还提供了一种测定血清中总甲状腺激素的试剂盒，包括：用于提取血清中总甲状腺激素的试剂，又包括：甲醇内标溶液和抗氧化剂，所述甲醇内标溶液为甲状腺激素13C6-T4浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液，所述抗氧化剂为柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液，混合水溶液中各物质浓度均为50g/L；以及用于对总甲状腺激素进行SPTPP衍生化的试剂，又包括：衍生反应缓冲溶液、衍生试剂和衍生反应终止溶液，所述衍生试剂为10mMSPTPP的甲醇溶液，所述衍生反应缓冲溶液为0.1M的磷酸缓冲液(PBS、pH8.0)，所述衍生反应终止溶液为含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。本专利技术的有益效果：与传统方法相比，本专利技术的优势如下：(1)本专利技术能够精确地检测微量血清中的总甲状腺激素的含量，由于甲状腺激素T4、T3结构均含有氨基基团，可通过对氨基进行特异性衍生化反应，获得离子化更强的衍生产物，从而极大提高检测灵敏度，实现微量血清(10μL)中甲状腺激素的精准快速测定，除了检测总T4、T3外，同时还可以检测总rT3的含量；(2)本专利技术采用乙酸乙酯作为衍生产物的提取剂，可使目标物质被较好的提取；(3)本专利技术提取剂只需最终经氮气吹干，后甲醇定容至500μl，可极大程度降低基质的干扰；(4)本专利技术选用甲状腺激素T4作内标物质，可精准的对血清中总T4、T3、rT3进行定量，提高了方法的准确性，同时有效地降低前处理过程中引起的误差；(5)本专利技术采用UPLC-MS/MS进行检测分析，其具有高效、快速、分离效果好、抗干扰能力强且具有非常好的重现性；(6)与传统方法相比，本专利技术方法具有血清使用量低，灵敏度高、测定准确等优点。附图说明图1为甲状腺激素T4、T3、rT3标准品SPTPP衍本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定血清中总甲状腺激素的方法，包括：首先提取待测血清中的总甲状腺激素，

【技术特征摘要】
1.一种测定血清中总甲状腺激素的方法，包括：首先提取待测血清中的总甲状腺激素，然后将总甲状腺激素提取液进行SPTPP衍生化，再对SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测，完成对血清中总甲状腺激素的测定。2.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述总甲状腺激素包括甲状腺激素T4、T3或者甲状腺激素T4、T3和rT3。3.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，通过以下方法提取待测血清中的总甲状腺激素：10-50μl待测血清加入等体积的甲醇内标溶液和1-5μl抗氧化剂，混匀置于-20-0℃环境下，15分钟后取出；大于8000g离心力，离心5-15分钟，取上清液即得甲状腺激素提取液。4.如权利要求3所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述抗氧化剂为柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液，混合水溶液中各物质浓度均为50g/L；所述甲醇内标溶液为甲状腺激素13C6-T4浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液。5.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述SPTPP衍生化包括：向300μl衍生反应缓冲溶液中加入10-20μl总甲状腺激素提取液，加入50μl衍生试剂，密封涡旋混匀，40℃衍生化反应10分钟，反应结束后立刻将其置于冰上同时加入衍生反应终止溶液700μl终止反应。6.如权利要求5所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，所述衍生试剂为10mMSPTPP的甲醇溶液；所述衍生反应缓冲溶液为pH8.0的0.1M的磷酸缓冲液；所述衍生反应终止溶液为含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。7.如权利要求1所述的一种测定血清中总甲状腺激素的方法，其特征在于，还包括进行UPLC-MS/MS检测前，将SPTPP衍生化产物用乙酸乙酯萃取，收集的萃取液用氮气吹干再用甲醇定...

【专利技术属性】
技术研发人员：万祎，崔洪洋，刘航，高世雄，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11