一种冰冻切片固定液套剂及固定方法技术

本发明专利技术涉及一种冰冻切片固定液套剂，其包括A液和B液，所述A液由10％甲醛、95％酒精和冰醋酸配制而成，所述B液由无水酒精和冰醋酸配制而成。还涉及一种固定冰冻切片的方法，包括使用上述冰冻切片固定液套剂固定冰冻切片的步骤。本发明专利技术的固定液套剂和固定方法能够快速固定组织、形态保存良好、染色鲜艳。尤其适于肾组织切片，在普通光镜下，肾小球、肾小管‑间质及肾血管结构的清晰度、细胞形态、胞核与胞质染色效果与石蜡切片高度相似。 1

【技术实现步骤摘要】
一种冰冻切片固定液套剂及固定方法
本专利技术涉及组织染色
，更特别地，涉及一种冰冻切片固定液套剂及固定方法。
技术介绍
移植前供肾活检，主要用于扩展指标的供体(expandedcriteriadonor，ECD)肾脏。ECD供肾质量与移植肾的长期预后直接相关，快速进行ECD供肾组织形态学评估一方面为移植肾长期存活提供基础保障，并可减少肾脏冷缺血时间与肾功能恢复的延迟；另一方面也对移植术后的状况与治疗具有预测与指导意义。石蜡切片虽对组织形态保存完好，但其耗时长，并且石蜡切片制备过程中有可能发生抗原丢失，因此常常采用冰冻切片染色来评估ECD供肾。冰冻切片染色分析是快速评估供肾组织形态学的关键技术，其制备过程的长短及切片质量直接影响供肾评估工作的效能。常规的冰冻切片制备虽耗时短，但组织形态基本被破坏，不利于观察。主要问题出在固定液上，冰冻组织的固定液种类较多，常用的有乙醇、甲醛、AAF液等。乙醇具有较好的脱水与收缩作用，但因能沉淀核蛋白而导致核着色不良。甲醛穿透力较强，对组织无明显收缩和膨胀作用，故无法消除因冷冻引起的细胞肿胀，再者其可与蛋白质交联，经其固定后的细胞器体积明显缩小，最后中性甲醛亦干扰酸性染料着色。AAF是一种改良的复合型固定液，对乳腺、胃肠道等组织有良好的固定作用，但由于其所含成分苦味酸对细胞器的破坏较大，因而不适合固定富含细胞器的肾组织。除了对组织形态的影响外，大多数冰冻组织固定液需要几分钟至十几分钟的固定时间，如果缩短固定时间，则达不到诊断要求。
技术实现思路
我们针对冰冻切片固定液以及固定方法进行了改良，以求最大限度地保持组织形态和缩短标本制备时间。基于以上工作，我们提供了一种冰冻切片固定液套剂，其包括A液和B液，所述A液由10％甲醛、95％酒精和冰醋酸配制而成，所述B液由无水酒精和冰醋酸配制而成。在一个优选实施方案中，所述A液中10％甲醛、95％酒精和冰醋酸的体积比为0.7-0.9:0.17-0.21:0.008-0.012，所述B液中无水酒精和冰醋酸的体积比为0.75:0.25。在一个优选实施方案中，所述A液中10％甲醛、95％酒精和冰醋酸的体积比为0.8:0.19:0.01，所述B液中无水酒精和冰醋酸的体积比为0.75:0.25。本专利技术还提供了一种固定冰冻切片的方法，包括使用上述冰冻切片固定液套剂固定冰冻切片的步骤。在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：S1：将冰冻切片于所述A液中孵育；S2：将在所述A液中孵育过的冰冻切片立即放入所述B液中孵育，孵育后即得到固定好的冰冻切片。在一个优选实施方案中，S1中所述A液的孵育时间为15s。在一个优选实施方案中，S2中所述B液的孵育时间为15s。在一个优选实施方案中，所述固定在20-25℃下进行。甲醛组织穿透力强，固定效果好，但需要较长的固定时间，并且它不能抵消因冰冻所致的细胞肿胀；95％乙醇渗透力强，但对组织有明显的收缩作用，导致固定不均匀；冰醋酸可迅速穿透组织，起效快且固定效果均匀，但可致胶原纤维肿胀，不能单独使用。本专利技术优化了固定液中各组分的比例，使各组分之间抵消单独使用时的缺陷，达到了良好的固定效果。另外还使用了两步固定法，第二步固定同时还起到脱水的作用，减少冰晶的出现，使冰冻切片在不影响抗原性的前提下更好地保持组织形态。且整个过程时间短操作简单，仅耗时30秒。本专利技术的固定液套剂和固定方法能够快速固定组织、形态保存良好、染色鲜艳。尤其适于肾组织切片，在普通光镜下，肾小球、肾小管-间质及肾血管结构的清晰度、细胞形态、胞核与胞质染色效果与石蜡切片高度相似。附图说明图1为本专利技术一个实施例的固定液套剂以及95％酒精、10％的中性甲醛、FAA固定液、10％的甲醛固定液固定肾组织的冰冻切片后进行HE染色的对比图；图2为本专利技术一个实施例的固定液套剂和AF固定液固定肾组织的冰冻切片后进行HE染色的对比图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。我们针对移植前ECD供肾经过了热缺血、冷缺血等导致组织细胞肿胀的特点，根据各种试剂对组织的渗透性等特点，探索与现有技术中的固定液成分不同的新型固定液，以期达到更好的固定效果和更短的固定时间。在研究中发现，当采用两种A和B两种固定液依次进行固定，并且A液中包含10％甲醛、95％酒精和冰醋酸(体积比0.7-0.9:0.17-0.21:0.008-0.012)，B液中包含无水酒精和冰醋酸(体积比0.75:0.25)时，能够达到很好的固定和染色效果。以下为使用本专利技术一个实施例的固定液套剂(A液中10％甲醛、95％酒精和冰醋酸的体积比为0.8:0.19:0.01，B液中无水酒精和冰醋酸的体积比为0.75:0.25)与现有技术中的固定液固定冰冻切片并进行HE染色的结果对比。所使用的现有技术中的固定液有：95％酒精、10％的中性甲醛、FAA固定液、10％的甲醛固定液。这些固定液均进行一次固定，固定时间为30s。固定温度均为室温(20-25℃)。固定后进行HE染色，并于显微镜下观察切片的清晰度、组织形态结构、细胞核/浆染色，以石蜡切片为评判标准。结果如图1以及表1和2所示，本实施例的固定液套剂固定染色后，清晰度高，形态结构保存完好，核染色和胞浆染色的着色度好，核浆对比鲜明，与石蜡切片相似度高。95％酒精、10％中性甲醛和10％甲醛固定后的染色结果在各方面均比较差，而FAA固定液比其他三种现有固定液虽然表现略好，但是在清晰度、结构形态保存和核浆对比方面均不如本实施例的固定液套剂。表1ECD供肾组织冰冻切片质量等级比较n(％)*与本实施例的固定液套剂相比，P＜0.05表2ECD供肾组织冰冻切片质量比较我们还将本实施例的固定液套剂与AF固定液进行了对比。结果如图2以及表3和4所示，AF固定液在除了核染色外的其他指标方面也基本不如本实施例的固定液套剂表3.ECD供肾组织冰冻切片质量等级比较n(％)表4.从以上结果可看出，本专利技术的固定液套剂能够快速固定组织、形态保存良好、染色鲜艳。尤其适于肾组织切片，在普通光镜下，肾小球、肾小管-间质及肾血管结构的清晰度、细胞形态、胞核与胞质染色效果与石蜡切片高度相似。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冰冻切片固定液套剂，其特征在于，包括A液和B液，所述A液由10％甲醛、95％酒

【技术特征摘要】
1.一种冰冻切片固定液套剂，其特征在于，包括A液和B液，所述A液由10％甲醛、95％酒精和冰醋酸配制而成，所述B液由无水酒精和冰醋酸配制而成。2.根据权利要求1所述的冰冻切片固定液套剂，其特征在于，所述A液中10％甲醛、95％酒精和冰醋酸的体积比为0.7-0.9:0.17-0.21:0.008-0.012，所述B液中无水酒精和冰醋酸的体积比为0.75:0.25。3.据权利要求2述的冰冻切片固定液套剂，其特征在于，所述A液中10％甲醛、95％酒精和冰醋酸的体积比为0.8:0.19:0.01，所述B液中无水酒精和冰醋酸的体积比为0.75:0.25。4.一种固定冰冻切片的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏华，朱红艳，张春，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42