快速检测汉赛巴尔通体的引物及制备方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种本发明专利技术涉及一种汉赛巴尔通体基因组DNA可视化快速检测方法的建立，属生物技术领域，筛选出1对特异性高、敏感性强的RPA引物，即上游引物

【技术实现步骤摘要】
快速检测汉赛巴尔通体的引物及制备方法和试剂盒
本专利技术涉及一种汉赛巴尔通体基因组DNA可视化快速检测方法的建立，属生物

技术介绍
巴尔通体病(Bartonellosis)是由不同种与亚种巴尔通体(Bartonella)引起的一类世界性分布的重要人兽共患传染病，是近年来在我国新发传染病之一。猫抓病(Cat-scratchdisease，CSD)是巴尔通体病(Bartonellosis)中的一种，主要是由汉赛巴尔通体(Bartonellahenselae，Bh)引起的新发人兽共患病。猫是该病原的天然宿主，当猫感染Bh后可以长期保持菌血症，但不出现明显的临床症状，并且可通过直接抓伤或咬伤将其传染给人，也可以通过猫蚤叮咬进行间接传播。该病在美国、德国、法国、荷兰、瑞士、意大利、澳大利亚、日本等国均存在，多发于儿童和青少年。近年来，随着我国宠物猫饲养量的增加，该病已经在我国江苏、浙江、安徽、山东和上海等20余个省市报道，人群感染Bh的病例呈快速上升的趋势。巴尔通体(Bartonella)是一种细小球状、杆状或环状的多形性微生物，革兰氏染色阴性，姬姆萨染色呈紫色或蓝色，Maechiavell染色呈红色，无鞭毛。在分类上，巴尔通体属变形菌纲、根瘤菌目、巴尔通体科、巴尔通体属成员，目前已经发现了22个种和亚种，其中至少9种对人有致病性，主要包括:杆菌样巴尔通体(Bartonellabacilliform)、五日热巴尔通体(Bartonellaquintana)、汉赛巴尔通体(Bartonellahenselae)、伊丽莎白巴尔通体(Bartonellaelizabethae)、文氏巴尔通体阿氏亚种(Bartonellavinsoniiarupensis)、文氏巴尔通体格霍夫亚种(Bartonellavinsoniisubsp.Berkhoffii)、克氏巴尔通体(Bartonellaclarridgeiae)、格雷范姆巴尔通体(Bartonellagrahamii)和文氏巴尔通体文森亚种(Bartonellavinsoniisubsp.vinsonii)等9种。猫是Bh的自然宿主，也是人感染Bh的重要传染源，因此防控人群Bh的感染急需要加强对宠物猫Bh感染的检测。目前，Bh感染常用的实验室检测方法包括病原学检测、血清学检测和分子生物学检测。由于该病原的特殊性，对营养要求十分苛刻，初次分离培养Bh的时间较长，因此病原学检测比较困难。间接免疫荧光检测法(IFA)是检测Bh常用的血清学方法，目前用于Bh感染的检测技术已形成商品化试剂盒，但IFA诊断方法在实际应用中仍存在诸多问题：首先，IFA检测需要价格昂贵的荧光显微镜；其次，该方法的检测结果完全依靠人工判读，易受检测技术人员经验的影响。PCR作为分子生物学检测常用的方法，由于其快速、特异和敏感，已广泛运用于Bh基因组DNA的检测。目前，用于Bh感染的PCR检测靶基因包括16SrRNA、枸橼酸合酶基因(gltA)、groEL和pap31基因等。然而，PCR方法也存在一定不足之处，如需要专门的仪器设备和技术，限制了该方法在临床上大规模的应用。重组酶聚合酶扩增(Recombinasepolymeraseamplification，RPA)是2006年由英国TwistDxInc公司研发的一种核酸恒温扩增技术，该技术可以在25-42℃恒温条件下快速完成核酸DNA的扩增，并且扩增产物可以通过探针法进行实时监测。RPA作用的原理是在目的DNA片段扩增的过程中，引物与重组酶形成复合物，并与DNA结合，沿着DNA链寻找引物的同源序列，当完成定位后，发生链交换反应并打开2条DNA单链间的氢键，单链绑定蛋白(SSB)与单链DNA链结合，阻止形成双链；聚合酶从发生链交换反应的位置开始复制DNA，从而完成了对目的DNA片段的扩增。与常规PCR相比，RPA技术不但具有敏感性高、特异性强、操作简便、反应时间短、不需复杂仪器设备等优点，并且可以与侧流层析检测技术(Lateralflowassay，LFA)相结合，不但可实现对DNA或RNA的体外恒温快速检测，而且可实现检测结果的可视化，在病原学检测领域上具有广泛的应用前景。本专利技术通过釆用重组酶聚合酶扩增-侧流层析(RPA-LFA)检测技术建立了Bh基因组DNA的可视化快速检测方法。本专利技术首先通过对GenBank中登录的Bh不同菌株gltA基因进行序列比对，筛选出高度保守基因片段为靶基因片段；根据RPA引物设计原则设计了3对RPA特异性引物，用地高辛标记上游引物5'端，用生物素标记下游引物5'端，通过对Bh基因组DNA进行RPA扩增试验，从中筛选出1对特异性高、敏感性强的RPA引物，建立了检测Bh基因组DNA的RPA检测方法。在此基础上，将胶体金标记的兔抗地高辛抗体复合物铺在结合垫上，NC膜上检测线包被链霉亲和素，质控线上包被羊抗兔IgG，配合加样垫和吸收垫组装成LFA试纸条。将RPA产物滴加于LFA试纸条加样垫上，建立了检测Bh基因组DNA的RPA-LFA可视化检测方法。利用建立RPA-LFA检测方法分别对附红细胞体、杆菌样巴尔通体、五日热巴尔通体、查菲埃里克体、大肠杆菌、沙门氏菌等多种致病菌进行扩增，证实所建立的BhRPA-LFA可视化检测方法具有很高的特异性。通过对临床样品的检测，并与常规PCR法进行比较，证实RPA-LFA方法具有高敏感性、特异性和准确性，为宠物猫Bh感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的可视化检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速检测汉赛巴尔通体的引物及该引物构成的试剂盒。通过釆用重组酶聚合酶扩增-免疫侧流层析检测技术(RPA-LFA)技术建立了Bh感染的可视化快速检测方法，通过对临床样品的检测，证实建立的BhRPA-LFA可视化检测方法具有很高的特异性和敏感性，为宠物猫Bh感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的临床检测方法。本专利技术通过釆用重组酶聚合酶扩增-侧流层析(RPA-LFA)检测技术建立了Bh基因组DNA的可视化快速检测方法。本专利技术首先通过对GenBank中登录的Bh不同菌株gltA基因进行序列比对，筛选出高度保守基因片段为靶基因片段；根据RPA引物设计原则设计若干对RPA特异性引物，用地高辛标记上游引物5'端，用生物素标记下游引物5'端，通过对Bh基因组DNA进行RPA扩增试验，从中筛选出1对特异性高、敏感性强的RPA引物，即上游引物的基因序列为<210>2，上游引物的基因序列为<210>2，建立检测Bh基因组DNA的RPA检测体系。在此基础上，将胶体金标记的兔抗地高辛抗体复合物铺在结合垫上，NC膜上检测线包被链霉亲和素，质控线上包被羊抗兔IgG，配合加样垫和吸收垫组装成LFA试纸条。将RPA产物滴加于LFA试纸条加样垫上，建立了检测Bh基因组DNA的RPA-LFA可视化检测体系。利用建立RPA-LFA检测方法分别对附红细胞体、杆菌样巴尔通体、五日热巴尔通体、查菲埃里克体、大肠杆菌、沙门氏菌等多种致病菌进行扩增，证实所建立的BhRPA-LFA可视化检测方法具有很高的特异性。通过对临床样品的检测，并与常规PCR法进行比较，证实RPA-L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测汉赛巴尔通体的引物，其特征在于，其上游引物的基因序列为<210>2，

【技术特征摘要】
1.一种快速检测汉赛巴尔通体的引物，其特征在于，其上游引物的基因序列为&lt;210&gt;2，下游引物的基因序列为&lt;210&gt;3。2.根据权利要求1所述的快速检测汉赛巴尔通体的引物，其特征在于，主要通过下列步骤制备：Bh基因组DNA的制备，取Bh对数生长期培养物收集菌体，菌体用TE缓冲液悬浮后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，测定提取DNA的浓度及纯度,待用；BhRPA引物的设计与合成，下载GenBank公布的Bh不同分离株gltA基因，通过BlastN和DNAMAN软件对BhgltA基因进行序列比对，筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列，设计若干对特异性引物，通过试验筛选出具有高特异性和敏感性的检测RPA引物；RPA反应体系的配制及操作程序，配制RPA反应体系，进行RPA反应，RPA最佳引物的筛选，以Bh基因组DNA为模板，分别用若干对BhRPA引物进行RPA扩增，随后用对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据特异性、敏感性和产物量筛选出RPA最佳引物。3.根据权利要求1或2所述的快速检测汉赛巴尔通体的引物，其特征在于，将所述的引物制备成胶体金标抗体：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，向其中加入兔抗地高辛抗体IgG，恒温缓慢振荡并离心处理，弃去上清液，沉淀溶解于Tris-HCL缓冲溶液中，得到胶体金标记的兔抗地高辛抗体IgG。4.一种快速检测汉赛巴尔通体的试剂，其特征在于，根据权利要求1或2所述的引物制备。5.一种快速检测汉赛巴尔通体的试剂盒，其特征在于，根据权利要求3所述的到胶体金标记的兔抗地高辛抗体IgG制备，所述试剂盒至少包含以下5个部分：加样垫、结合垫、吸收垫、NC膜和PVC塑料垫，所述的NC膜上设有检测线即T线和质控线即C线，其制备过程为：将制备的胶体金标记兔抗地高辛抗体IgG用移液枪...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆玲，乔军，李重阳，乔梦凡，伍晔晖，孟丹，贡莎莎，王熙凤，李静，张凯，田路路，张星星，张再超，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65