鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：将新鲜鲻鱼的鱼肉制备成鱼糜，将鱼糜冻干后粉碎，得冻干鱼粉；将冻干鱼粉利用乙酸乙酯进行脱脂，冷冻干燥后粉碎，得到脱脂鲻鱼蛋白粉(GM)；将脱脂鲻鱼蛋白粉(GM)进行酶解，然后离心，所得离心液冷冻干燥，得粗抗氧化肽(HGM)。将粗抗氧化肽(HGM)进行进一步的分离纯化，能获得鲻鱼蛋白源抗氧化肽。采用本发明专利技术的方法能获得抗氧化活性强的鲻鱼蛋白源抗氧化肽。 1

【技术实现步骤摘要】
鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法
本专利技术属于功能食品
，涉及一种鲻鱼蛋白源制备抗氧化肽的方法。
技术介绍
鲻鱼(Mugilcephalus)，隶属于辐鳍鱼纲鲻形目鲻科鲻属，被联合国农粮组织推荐为世界海淡水养殖的三大鱼类之一，也是我国东部和南部沿海咸淡水养殖的重要经济鱼类之一。作为低值经济鱼类的一种，鲻鱼易于养殖，且具有产量高、蛋白质含量丰富以及氨基酸种类齐全等特点。当前，关于鲻鱼的研究绝大数停滞在生活习性以及营养组成分析上，关于鲻鱼的综合利用和提高其附加值的研究鲜有报道，从而致使鲻鱼利用率低下，造成资源浪费。随着我国渔业养殖技术的进步以及水产品加工业的发展，提高低值鱼类的附加值以实现其综合利用成为渔业发展的必然趋势，同时也为鲻鱼的综合利用提供了契机，进一步研究鲻鱼资源，可以为鲻鱼的高值化利用和开发，甚至于其他低值水产品的高值化利用与开发提供理论依据和参考。在生物体正常新陈代谢过程中，机体会不断地产生各种活性氧自由基，过多的自由基得不到及时有效清除会严重威胁人类健康，天然抗氧化剂因可安全有效的清除人体内过多的自由基而日益引起人们的兴趣。因而，来源于食物抗氧化肽因安全高效得到了充分发展。例如：专利号ZL201210230756.6(授权公告号为CN103524596A)的中国专利技术专利《一种鲨鱼蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途》、专利号为ZL201310152590.5(授权公告号为CN103194519A)的中国专利技术专利《一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用》等专利均公开了食物蛋白源的抗氧化肽。然而，目前尚未有以鲻鱼为蛋白源制备抗氧化的报道，以鲻鱼为蛋白源制备抗氧化肽，对于鲻鱼的高值化利用与拓展抗氧化肽具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种抗氧化活性强的鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：1)、将新鲜鲻鱼的鱼肉制备成鱼糜，将鱼糜冻干后粉碎，得冻干鱼粉；2)、脱脂：将冻干鱼粉与乙酸乙酯按1g:2～5ml的料液比混合后于50～60℃(水浴条件)搅拌100～120min从而进行脱脂；抽滤(以去除乙酸乙酯)，所得滤饼冷冻干燥后粉碎(过60～100目筛)，得到脱脂鲻鱼蛋白粉(GM)；3)、酶解：将脱脂鲻鱼蛋白粉(GM)与水按1:15～25的质量比混合作为反应体系，调节反应体系的pH值为6～8(可用1MNaOH进行pH值的调节)、温度为45～55℃，按4.5～6.5U酶/mg脱脂鲻鱼蛋白粉(GM)的加酶量加入蛋白酶后保温酶解3～5小时；酶解时间到达后灭酶，然后离心，所得离心液冷冻干燥，得粗抗氧化肽(HGM)。该粗抗氧化肽(HGM)的分子量绝大部分分布在10kDa以下，且小于3kDa的组分占到了50％以上。作为本专利技术的鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法的改进：将粗抗氧化肽(HGM)进行分离纯化，包括以下步骤：①通过凝胶色谱层析法对鲻鱼酶解物--粗抗氧化肽(HGM)进行初步分离：将HGM通过葡萄糖凝胶SephadexG-25层析进行分离，测定各组分的抗氧化活性，多次层析收集活性最高的组分HGM-F4；②将HGM-F4用反相高效液相色谱进一步分离，得到鲻鱼抗氧化肽(鲻鱼蛋白源抗氧化肽)HGM-F4-B4(即组分B4，抗氧化活性最高)。该抗氧化肽组分主要由分子量为452.3434Da和339.2600Da的小肽组成。作为本专利技术的鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法的进一步改进，所述步骤①为：选用凝胶柱规格为2.6cm×60cm，凝胶介质为SephadexG-25，上样量为50～100mg，以超纯水为洗脱缓冲液，控制流速0.6mL/min，每五分钟收集一管，洗脱时间295～385min的为组分HGM-F4。说明：波长280nm下检测每管吸光度，收集各洗脱峰，浓缩后进行冷冻干燥，以DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率及还原力为指标筛选出抗氧化活性最高的组分。得到4个组分，其中活性最高的为洗脱时间295-385min的组分HGM-F4(即，组分F4)，其(见图5)；即，根据测试结果，反复上样收集活性最高的4号吸收峰(见图5)对应的洗脱液。作为本专利技术的鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法的进一步改进：蛋白酶为木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶。作为本专利技术的鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法的进一步改进，步骤②为：组分HGM-F4用半制备型RP-HPLC进行分离，采用半制备柱YMC-PACKODS-AQC18柱，上样量为5mL，洗脱条件如下：其中流动相A为含0.5％三氟乙酸的超纯水，流动相B含0.5％三氟乙酸的乙腈。即，流动相A由体积含量为0.5％三氟乙酸和体积含量为99.5％的超纯水组成；流动相B由体积含量为0.5％三氟乙酸和体积含量为99.5％的乙腈组成。作为本专利技术的鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法的进一步改进，所述步骤3)中，于95～100℃的水浴锅中灭酶10～15分钟；所述离心为8000～12000r/min、3～5℃、离心8～12min。作为本专利技术的鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法的进一步改进：所述步骤1)中，新鲜鲻鱼，去除鱼头、鱼尾及内脏，鱼肉经高速组织匀浆机斩拌，得鱼糜；于-80℃冻干至恒重，粉碎至过80目筛，得冻干鱼粉。上述冻干鱼粉可于-18℃冰箱中保存。本专利技术是利用鲻鱼肉蛋白为原料(以鲻鱼为起始原料)，利用蛋白酶进行水解，制备具有较高活性的抗氧化肽，包括以下内容：1)选用合适方法对鲻鱼肉进行脱脂；2)取适量鲻鱼蛋白粉，选取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶水解鲻鱼蛋白，以抗氧化活性为评价指标，筛选出制备抗氧化肽的最佳蛋白酶；3)通过单因素试验和响应面法优化酶解鲻鱼蛋白制备粗抗氧化肽HGM的工艺条件；4)通过Sephadex-G25和反相高效液相色谱进行分离，得到活性最好的抗氧化组分。本专利技术制备而得的粗抗氧化肽(HGM)可用作功能食品基料。抗氧化肽组分HGM-F4-B4则有医用价值。本专利技术具有如下技术优势：1)、本专利技术的脱脂工艺，与常用的碱法离心脱脂、乙醇脱脂、异丙醇脱脂和脂肪酶脱脂法相比，具有脱脂率高(84.83％)、蛋白损失率低(14.95％)的优点。2)、粗抗氧化肽HGM抗氧化活性良好，营养价值高，而且具有较好的起泡性和乳化特性，可用作功能性食品基料。3)、工艺简单，便于实施。提高了鲻鱼产品的附加值。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为不同的鲻鱼脱脂工艺所得结果的比较；A、不同脱脂方法对鲻鱼脱脂效果的比较；B、乙酸乙酯脱脂时间对酶解产物的DPPH清除活性的影响；C、乙酸乙酯脱脂时间对酶解产物的抗脂质过氧化能力。T0、T40、T80、T120分别代表脱脂时间为0min、40min、80min以及120min的鱼肉样品。图2为鲻鱼鱼肉经不同蛋白酶降解的产物的活性。图3为在不同浓度下HGM-1和HGM-2的体外抗氧化活性，并与GM和VC做比较；A、超氧阴离子自由基抑制率；B、DPPH自由基抑制率；C、羟基自由基抑制率；D、铁离子还原能力；E、亚铁离子螯合能力；F、抑制脂质过氧化能力。图4为HGM的功能特性；A、溶解性；B、起泡性和起泡稳定性；C、乳化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：

【技术特征摘要】
1.鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：1)、将新鲜鲻鱼的鱼肉制备成鱼糜，将鱼糜冻干后粉碎，得冻干鱼粉；2)、脱脂：将冻干鱼粉与乙酸乙酯按1g:2～5ml的料液比混合后于50～60℃搅拌100～120min从而进行脱脂；抽滤，所得滤饼冷冻干燥后粉碎，得到脱脂鲻鱼蛋白粉(GM)；3)、酶解：将脱脂鲻鱼蛋白粉(GM)与水按1:15～25的质量比混合作为反应体系，调节反应体系的pH值为6～8、温度为45～55℃，按4.5～6.5U酶/mg脱脂鲻鱼蛋白粉(GM)的加酶量加入蛋白酶后保温酶解3～5小时；酶解时间到达后灭酶，然后离心，所得离心液冷冻干燥，得粗抗氧化肽(HGM)。2.根据权利要求1所述的鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征是：将粗抗氧化肽(HGM)进行分离纯化，包括以下步骤：①、通过凝胶色谱层析法对粗抗氧化肽(HGM)进行初步分离：将HGM通过葡萄糖凝胶SephadexG-25层析进行分离，测定各组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分HGM-F4；②、将HGM-F4用反相高效液相色谱进一步分离，得到鲻鱼抗氧化肽HGM-F4-B4。3.根据权利要求2所述的鲻鱼蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征是，所述步骤①为：选用凝胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：周涛，崔帅，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33