一种具有β-半乳糖苷酶活性的酶蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种β‑半乳糖苷酶AgWH2A及其应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；编码上述β‑半乳糖苷酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。本发明专利技术的β‑半乳糖苷酶能降解琼寡糖非还原端的D‑半乳糖(D‑Gal)，以及生成对应的新琼寡糖，因此可用于新琼寡糖的制备。相较于化学方法，酶法具有条件温和，环境友好，催化活性高等特点，故其是制备新琼寡糖很有前景的方法。本发明专利技术的大肠杆菌重组株，pET‑21a/BL21(DE3)表达的重组β‑半乳糖苷酶，表达水平高，易于纯化，具有良好的耐碱性和酶活性，为新琼寡糖的制备提供了新的酶源。 1

【技术实现步骤摘要】
一种具有β-半乳糖苷酶活性的酶蛋白及其应用
本专利技术属于功能酶筛选
，具体涉及一种具有β-半乳糖苷酶活性的酶蛋白及其应用。
技术介绍
β-半乳糖苷酶(β-galactosidase；EC3.2.1.23)，全名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，商品名为乳糖酶，能作用于β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷键发生水解，有些还具有转糖苷作用生成低聚半乳糖，该酶广泛存在于动物、植物及微生物中。现已被报道的β-半乳糖苷酶主要属于四个糖苷水解酶家族，GH1，GH2，GH35，GH42家族。β-半乳糖苷酶的最初应用是利用其水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。琼脂糖是红色巨藻的主要组成成分(Rhodophyta)，是由D-半乳糖和L-3,6-内醚半乳糖为单元交替组成的线性多糖。琼脂糖能被海洋细菌中的琼胶酶降解，产生一系列低聚合度的寡糖，据其聚合度大小以及单糖排列方式的不同，可分为琼胶寡糖和新琼寡糖。前期工作中，专利技术人所在的实验室已经从AgarivoransgilvusWH0801菌中克隆表达了三个β琼胶酶AgWH50A，AgWH50B和AgWH50C，一个新琼二糖水解酶AgaWH117，这些酶对于寡糖的制备都有着很重要的作用，AgWH50A和AgWH50B反应主要的产物是新琼四糖，AgWH50C作用于琼脂糖的主要产物是新琼二糖，但琼寡糖不能进一步被已经克隆表达的现有的糖苷水解家族的酶水解。相较于化学方法，酶法具有条件温和，环境友好，催化活性高等特点，因此制备β-半乳糖苷酶对于探索A.gilvusWH0801菌用于琼脂糖的降解有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有β-半乳糖苷酶活性的酶蛋白及其应用，利用该酶的水解能力，应用于琼脂糖的降解，得到新琼寡糖。本专利技术的具有β-半乳糖苷酶活性的酶蛋白，包含有：1)氨基酸序列为SeqIDNO：1的酶；2)与1)中酶具有90％或以上同源性，能降解琼寡糖来制备新琼寡糖和D-半乳糖的酶；上述2)中酶，是从淡黄色噬琼胶菌(Agarivoransgilvus)中扩增获得的；所述的淡黄色噬琼胶菌(A.gilvus)，为A.gilvusWH0801株；编码上述酶蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SeqIDNO：2。本专利技术提供一种重组载体，是携带上述编码基因的载体，其中一种具体的载体为pET-21a(+)。本专利技术提供一种携带上述载体的重组表达宿主，其一种为大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术的β-半乳糖苷酶用于降解琼寡糖来制备新琼寡糖和D-半乳糖。本专利技术所提供的具有β-半乳糖苷酶活性的酶蛋白能降解琼寡糖非还原端的D-半乳糖(D-Gal)，以及生成对应的新琼寡糖，因此可用于新琼寡糖的制备。相较于化学方法，酶法具有条件温和，环境友好，催化活性高等特点，故其是制备新琼寡糖很有前景的方法。附图说明图1：本专利技术的β-半乳糖苷酶AgWH2A家族确认的进化树分析示意图；图2：本专利技术的β-半乳糖苷酶AgWH2A的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道M是蛋白Marker，泳道1是空载，泳道2是表达后菌体破碎液上清，泳道3是纯化后的β-半乳糖苷酶AgWH2A；图3：AgWH2A酶学性质研究；其中，图a是AgWH2A最适温度，图b是AgWH2A最适pH，图c是AgWH2A的pH稳定性，图d是AgWH2A的温度稳定性(数据均为最少三次重复取平均值)；图4：不同化学物质对相对酶活的影响；图5：本专利技术的β-半乳糖苷酶AgWH2A作用于琼胶寡糖的产物TLC结果，表明琼三糖被水解为D-半乳糖和新琼二糖；琼五糖被水解为D-半乳糖和新琼四糖；琼七糖被水解为D-半乳糖和新琼六糖；图6：本专利技术的β-半乳糖苷酶AgWH2A作用于琼胶寡糖的产物HPLC结果，表明琼三糖，琼五糖和琼七糖依次被降解为D-半乳糖和相对应的新琼寡糖；图7：本专利技术的β-半乳糖苷酶AgWH2A降解琼胶寡糖的示意图。具体实施方式本专利技术用到了分子生物学和酶催化领域使用的常规技术和方法，下面将结合实施例和附图对该专利技术进行详细的描述，但保护范围并不仅限于此。对于本专利技术中的术语解释如下：1、L-3,6-内醚半乳糖：3,6位羟基脱水形成内醚键的L型半乳糖。2、琼寡糖：单糖L-3,6-内醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖(D-Gal)以α-1,3糖苷键和β-1,4糖苷键连接形成的寡糖，D-Gal在非还原端。3、新琼寡糖：单糖L-3,6-内醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖(D-Gal)以α-1,3糖苷键和β-1,4糖苷键连接形成的寡糖，L-AHG在非还原端。本专利技术通过分析基因注释和克隆表达的方法，得到一个新型具有良好性状的GH2家族β-半乳糖苷酶，该β-半乳糖苷酶包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的酶；2)编码上述β-半乳糖苷酶的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:2；本专利技术的β-半乳糖苷酶AgWH2A具有水解琼寡糖的能力，生成D-半乳糖和相应的新琼寡糖。如图1-图7，表1所示，通过以下四个实施例详细说明本专利技术的β-半乳糖苷酶AgWH2A蛋白及其应用。实施例1：β-半乳糖苷酶AgWH2A的基因片段确定在之前的研究中杜宗军实验室筛选得到一株高产琼胶酶的菌株A.gilvusWH0801，已经克隆表达了三个β琼胶酶AgWH50A，AgWH50B和AgWH50C，一个新琼二糖水解酶AgaWH117，基于已经发表的应用于琼脂糖降解的β-半乳糖苷酶，通过对A.gilvusWH0801全基因组进行测序分析得到4个β-半乳糖苷酶基因及其基因序列，标记为agWH2A,agWH2B,agWH2C和agWH2D。本申请专利技术人通过进化树分析(图1)，agWH2A片段编码基因属于糖苷水解酶GH2家族，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1,编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2；NCBI比较结果表明本专利技术的agWH2A酶与β-galactosidaseprotein(编号为SJN27606)fromVibriosp.JB196只有60％的同源性，并进行下一步具体的酶学性质分析。实施例2：β-半乳糖苷酶AgWH2A的克隆表达及纯化在2216E海水培养基中培养淡黄色噬琼胶菌WH0801，用试剂盒提取DNA基因组。根据确定的agWH2A基因，设计该基因的全长引物，上游引物：ACGCGTCGACATGCCTTGTAAAACTTTA(SalⅠ酶切位点)，下游引物：AAATATGCGGCCGCGCCATGGTTCACCTCTAG(NotⅠ酶切位点)。以基因组为模板，条件为：98℃2分钟，然后98℃10秒，55℃15秒，72℃15秒，3个步骤进行35个循环，最后72℃延伸4分钟。琼脂糖凝胶电泳显示在2.0kb的位置有明显的单一条带，将单一条带切胶回收，即为agWH2A基因的片段。用SalⅠ和NotⅠ双酶切，酶切后的目的片段与同样酶切的pET-21a(+)载体连接，重组质粒先导入EscherichiacoliDH5α，挑选阳性克隆子进行PCR，电泳后条带大小相符合的单克隆送至测序，测序结果完全正确的克隆子进行下一步操作，将重组质粒pET21a-agWH2A转入表达宿主BL21(DE3)中。挑取大肠杆菌重组株单克隆接种在5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12小时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有β‑半乳糖苷酶活性的酶蛋白，其特征在于，所述的酶蛋白包含有：

【技术特征摘要】
1.一种具有β-半乳糖苷酶活性的酶蛋白，其特征在于，所述的酶蛋白包含有：1)氨基酸序列为SeqIDNO：1的酶；2)与1)中酶具有90％或以上同源性，能降解琼寡糖来制备新琼寡糖和D-半乳糖的酶。2.如权利要求1所述的酶蛋白，其特征在于，所述的2)中酶，是从淡黄色噬琼胶菌(Agarivoransgilvus)中获得的。3.如权利要求2所述的酶蛋白，其特征在于，所述的淡黄色噬琼胶菌(A.gilvus)，为A.gilvusWH0801株。4.一种编码基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的酶蛋白。5.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛相朝，杨晓庆，刘振，孙建安，薛长湖，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37