一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。本发明专利技术的突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第106位的缬氨酸突变成了异亮氨酸。本发明专利技术摇瓶诱导10h得到的突变酶PvEH1V106I催化活性为234.75U/g，是野生型酶(157.15U/g)的1.49倍。 1

【技术实现步骤摘要】
一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体
本专利技术涉及一种催化活性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。
技术介绍
环氧化物水解酶(epoxidehydrolases,EHs,EC3.3.2.-)广泛存在于动物、植物、微生物等自然环境中，它能够通过添加一分子水到环氧环上使得环氧化物开环水解形成相应的二醇，此过程无需辅因子以及金属离子的参与。由于环氧化物水解酶在催化水解时具有高立体选择性、反应条件温和及对环境污染小等特点，近年来人们越来越重视它在生物催化水解外消旋环氧化物的应用价值。绝大多数的EHs按照催化机理的不同可分为三类：一是柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶家族，代表为R.erythropLisEH(EC3.3.2.8)；二是白三烯A4水解酶；三是α/β-折叠环氧化物水解酶家族。目前研究最多的为α/β-折叠环氧化物水解酶家族。随着结构生物学的迅速发展，己有多种环氧化物水解酶的结构得到解析，如：放射性土壤杆菌环氧化物水解酶AgrobacteriumradiobacterAD1EH(ArEH)，黑曲霉环氧化物水解酶AspergillusnigerEH(AnEH)，人环氧化物水解酶HomosapienssEH(HssEH)，鼠环氧化物水解酶Musmsculusshe(MmsEH)，结核分枝杆菌环氧化物水解酶MycobacteriumtuberculosisEHA(MtEHA)，以及来自土豆环氧化物水解酶SolanumtuberosumEH(StEH)等。α/β-折叠环氧化物水解酶家族的催化机制通常分为两步：1)两个酪氨酸残基通过氨键接合环氧底物环氧乙烷上的氧原子，然后环氧化物水解酶上的天冬氨酸残基亲核攻击环氧环上其中一个碳原子，形成二元醇－酯－酶共价结合的二聚体；2)一分子的水由于受到Asp/Glu-His残基的活化产生一个烃基，从而攻击之前形成的共价二聚体，释放出邻位二醇产物，亲核试剂得重生。虽然近年来环氧化物水解酶由于其反应时无需辅因子或金属离子的参与、反应条件温和、对环境友好等优点在制备光学纯的底物和产物上受到广泛重视，但是在实验室和工业规模的应用上，环氧化物水解酶因其酶活较低等缺陷限制了其进一步的发展。蛋白质工程的优势在于能够在一定程度上克服以上一系列的缺点。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个问题是提供一种催化活性提高的环氧化物水解酶(PvEH1)突变体。所述突变体是：(a)氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白质；(b)在严格条件下与(a)限定的氨基酸序列杂交且编码具有环氧化物水解酶活性的氨基酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述突变体的基因的核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。本专利技术还提供获得所述突变体的方法，是在如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列基础上，将第106位的缬氨酸突变成了异亮氨酸(V106I)。在本专利技术的一种实施方式中，以携带编码环氧化物水解酶的基因PvEH1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主；培养宿主使之产环氧化物水解酶突变体。本专利技术还提供一种表达所述环氧化物水解酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：以携带编码环氧化物水解酶的基因PvEH1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述携带编码环氧化物水解酶的基因PvEH1的重组质粒为pET28a(+)-pveh1，表达宿主为E.coliBL21(DE3)。本专利技术还提供一种应用所述环氧化物水解酶突变体水解邻甲基苯基缩水甘油醚的方法，是以所述突变体或表达所述突变体的基因工程菌为催化剂，在磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4,pH7.0)中催化外消旋邻甲基苯基缩水甘油醚(底物浓度为10mM)。本专利技术的突变体命名方式：采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如V106I，表示位置106的氨基酸由亲本环氧化物水解酶的缬氨酸Val替换成异亮氨酸Ile，位置的编号对应于亲本环氧化物水解酶的氨基酸序列的相应位点。本专利技术的有益效果：本专利技术的突变体是在SEQIDNO.2所示的氨基酸的基础上，将第106位的缬氨酸突变成了异亮氨酸。本专利技术摇瓶诱导10h得到的突变酶PvEH1V106I催化活性为234.75U/g，是野生型酶(157.15U/g)的1.49倍。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本专利技术的内容而非限制本专利技术的保护范围。实施例1：突变酶基因及其表达质粒的构建一、质粒pET-28a(+)-pveh1的获得重组E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-pveh1的培养基组成为：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl1％。将重组菌接种于培养基装液量为5mL试管中于37℃、215rpm振荡培养12h。培养结束后，将菌体于12,000rpm下离心1min并收集细胞，利用质粒提取试剂盒PurePlasmidMiniKit(康为世纪生物科技有限公司)提取质粒pET-28a(+)-pveh1；其中质粒pET-28a(+)-pveh1中的环氧化物水解酶PvEH1的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示(核苷酸序列如SEQIDNO.4所示)。二、重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-pveh1(V106I)的构建设计并合成特异性定点突变引物如下：以V106I-F、V106I-R(SEQIDNO.5和SEQIDNO.6)为上下游引物，以pET28a(+)-pveh1为模板，利用QuickChangeTM试剂盒进行PCR，PCR条件如下：预变性95℃，4min；变性98℃，10s；退火55℃，15s；延伸72℃，8min；从变性到延伸循环30次，最后充分延伸72℃，10min。体系为25μL，以野生型pveh1的质粒为模板。PCR完成后，加入0.5μLDpnI及1μL10×TBuffer，25℃过夜消化。转化参照生工超级感受态细胞制备试剂盒使用说明书。将获得的突变酶表达载体由上海睿迪生物有限公司测序确认碱基序列。实施例2：突变酶PvEH1V106I的获取将E.coliBL21-pveh1V106I单菌落接种于2mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、215r/min培养过夜；取1mL培养液转接于50mL相同的培养基中，培养至OD600为0.6-0.8时，添加IPTG(终浓度0.5mmol/L)，20℃诱导10h。收集菌体，每g湿菌体用10mL磷酸钠缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4,100mmol/L,pH7.0)悬浮得到菌悬液。实施例3：突变酶PvEH1V106I催化活性的测定在2mLEP管中加入30μL菌悬液和920μL磷酸盐缓冲液，25℃保温5min，再加入50μL外消旋邻甲基苯基缩水甘油醚(rac-o-GMPE，终浓度10mmol/L)立即记时反应10min后，取反应液200μL加入1mL乙酸乙酯终止反应。微孔过滤后，样品分析采用正相HPLC、OD-H柱和紫外检测仪。流动相为正己烷/异丙醇(80:20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菜豆环氧化物水解酶突变体，其特征在于，所述环氧化物水解酶突变体是：

【技术特征摘要】
1.一种菜豆环氧化物水解酶突变体，其特征在于，所述环氧化物水解酶突变体是：(a)氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白质；(b)在严格条件下与(a)限定的氨基酸序列杂交且编码具有环氧化物水解酶活性的氨基酸序列。2.一种编码权利要求1所述的环氧化物水解酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。3.一种获得权利要求1所述的环氧化物水解酶突变体的方法，其特征在于，是在如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列基础上，将第106位的缬氨酸突变成了异亮氨酸。4.含有编码权利要求1所述突变体的基因的载体。5.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。6.根据权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，阚婷婷，王婷婷，苏永君，李剑芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32