一株林可胺类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株林可胺类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。本发明专利技术采用克林霉素氯取代衍生物作为半抗原，将半抗原通过活化酯法偶联牛血清蛋白(BSA)，得到免疫抗原，与弗氏佐剂混合均匀后，通过皮下注射免疫BALB/c小鼠；将克林霉素采用羰基二咪唑(CDI)法与鸡蛋白蛋白(OVA)偶联，作为包被抗原，用于小鼠血清以及细胞上清检测。将免疫小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到一株群选性的杂交瘤细胞株。本发明专利技术提供的细胞株对克林霉素、林可霉素和吡利霉素均具有较好的抑制，可以满足目前市场上对林可胺类多残免疫检测产品的需求。 1

【技术实现步骤摘要】
一株林可胺类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株林可胺类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测

技术介绍
林可胺类药物(lincosamides)具有抗革兰氏阳性需氧菌和革兰氏阳性或阴性厌氧菌活性，兽医临床常用的有林可霉素、克林霉素和吡利霉素。动物源食品中林可胺类药物残留可引起肾功能障碍和革兰氏阳性菌耐药性增加，我国和欧盟都对动物源食品中的最大残留限量做了相关规定，因此，亟待建立一种快速、灵敏、准确的林可胺类药物残留检测方法，确保动物性食品的安全。目前检测林可胺类药物残留的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC/MS)等仪器检测方法，而免疫分析方法相对较少。其中仪器检测方法检测准确，但仪器昂贵，操作复杂，时间长，样品前处理繁琐。免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种林可胺类通用性单克隆抗体的制备方法，通过细胞株的筛选，得到的抗体对克林霉素、林可霉素和吡利霉素都具有较好检测灵敏度，可以用来建立林可胺类总量的免疫学检测方法。本专利技术的第一个目的是提供一株单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14691，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术的第二个目的是提供一种检测林可胺类药物的方法，所述方法是利用上述的单克隆细胞株分泌产生的林可胺类特异性单克隆抗体。本专利技术的第三个目的是提供一种林可胺类特异性单克隆抗体，由上述的杂交瘤细胞所分泌产生。在本专利技术的一种实施方式中，所述的林可胺类特异性单克隆抗体的应用是指用于食品安全检测中林可胺类药物残留的分析检测。本专利技术的第四个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒含有所述的单克隆细胞株或者所述的林可胺类特异性单克隆抗体。在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂盒用于检测林可胺类药物。本专利技术的第五个目的是提供所述的试剂盒在检测林可胺类药物中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述的应用包括在检测克林霉素、林可霉素或吡利霉素中的应用。本专利技术的第六个目的是提供一种林可胺类通用性单克隆抗体的制备方法，所述方法步骤为：(1)半抗原的设计：利用β-巯基丙酸与克林霉素的缩合反应制备得到，具体合成路线见图1。用20mL二甲基亚砜(DMSO)溶解9.6g克林霉素原药，加入2.3gKOH，边搅拌边缓慢滴加β-巯基丙酸溶液(3.2gβ-巯基丙酸溶解于10mLDMSO)，油浴升温至100℃，反应2h，待产物自然冷却至室温后，加入50mL水，以6mol/LHCl调反应液至pH3，然后以50mL二氯甲烷萃取，提取液经无水Na2SO4干燥、浓缩、结晶，得黄色晶体，即目标化合物，通过质谱鉴定。(2)完全抗原的制备：采用克林霉素氯取代衍生物，通过活化酯法偶联牛血清蛋白(BSA)，得到免疫抗原Lin-BSA；将克林霉素采用羰基二咪唑(CDI)法与鸡蛋白蛋白(OVA)偶联，作为包被抗原Lin-OVA。(3)动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠，首次免疫用100μg偶联抗原与等量福氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg偶联抗原与等量福氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量偶联抗原加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；(4)细胞融合与筛选：在冲击免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为1450)方法进行细胞融合，具体步骤如下：A.无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；B.收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；C.将脾细胞和SP2/0细胞按照10:1(数量比)的比例混合，离心后用50％PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选；筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用克林霉素、林可霉素和吡利霉素为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对四个标准品均具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌林可胺类通用性单克隆抗体的细胞株；(5)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。本专利技术的有益效果：本专利技术设计克林霉素的氯取代物作为半抗原，将其与BSA采用活化酯法进行偶联得到免疫原；免疫BALB/c小鼠，将克林霉素原药采用CDI法与OVA偶联得到包被原，用于小鼠血清和细胞上清的筛选。通过细胞融合和筛选，最终获得了能够稳定分泌对克林霉素、林可霉素、吡利霉素等均具有较好亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体的细胞株，测定单克隆抗体对克林霉素、林可霉素、吡利霉素的半数抑制率(IC50)分别为：0.379ng/mL、4.339ng/mL、19.314ng/mL；使得氯霉素类的多残免疫检测方法成为了可能。生物材料保藏一株单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14691，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。附图说明：图1为半抗原的设计；图2为克林霉素氯取代衍生物质谱图；图3为抗体对克林霉素、林可霉素和吡利霉素的标准曲线。具体实施方式本专利技术通过将完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对克林霉素、林可霉素、吡利霉素均有较好灵敏度的通用性单克隆抗体。实施例1：林可胺类通用性单克隆抗体的制备(1)半抗原的设计：利用β-巯基丙酸与克林霉素的缩合反应制备得到，具体合成路线见图1。用20mL二甲基亚砜(DMSO)溶解9.6g克林霉素原药，加入2.3gKOH，边搅拌边缓慢滴加β-巯基丙酸溶液(3.2gβ-巯基丙酸溶解于10mLDMSO)，油浴升温至100℃，反应2h，待产物自然冷却至室温后，加入50mL水，以6mol/LHCl调反应液至pH3，然后以50mL二氯甲烷萃取，提取液经无水Na2SO4干燥、浓缩、结晶，得黄色晶体，即目标化合物，通过质谱鉴定。(2)完全抗原的制备：采用克林霉素氯取代衍生物，通过活化酯法偶联牛血清蛋白(BSA)，得到免疫抗原Lin-BSA；将克林霉素采用羰基二咪唑(CDI)法与鸡蛋白蛋白(OVA)偶联，作为包被抗原Lin-OVA。具体合成方法如下：A.Lin-BSA的合成：称取10mg半抗原，溶于3ml0.1MpH6.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通

【技术特征摘要】
1.一株单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14691，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.一种检测林可胺类药物的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1所述的单克隆细胞株分泌产生的林可胺类特异性单克隆抗体。3.一种林可胺类特异性单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞所分泌产生。4.权利要求3所述的林可胺类特异性单...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，郭玲玲，胥传来，徐丽广，马伟，刘丽强，宋珊珊，吴晓玲，
申请(专利权)人：江南大学，无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32