一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法，属于酶工程领域。本发明专利技术通过在目的基因N端加入不同信号肽的策略，构建重组分泌表达质粒,并在枯草芽孢杆菌表达系统中进行表达，筛选到PhoD信号肽效果最佳，提高了亮氨酸脱氢酶分泌表达水平，为对照菌的2.2倍。此方法中枯草芽孢杆菌为安全菌株，重组蛋白直接分泌到胞外，使后期分离操作简单，更加适合工业化应用，为亮氨酸脱氢酶在医疗诊断等领域的应用提供了方便。 1

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法
本专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法，属于酶工程领域。
技术介绍
亮氨酸脱氢酶(LeucineDehydrogenase；EC1.4.1.9；LeuDH)属于氧化还原酶类，以NAD+为辅酶，能可逆的催化L-亮氨酸及一些支链氨基酸产生相应的酮酸及其类似物，也可以催化α-酮酸还原成手性氨基酸。目前在多种细菌中均发现亮氨酸脱氢酶的存在，研究较多的亮氨酸脱氢酶主要来源于芽孢杆菌，且多为6-8个亚基的同源多聚体。亮氨酸脱氢酶在医药等行业有广泛应用，可用于医药中间体手性氨基酸的生物催化；临床生化诊断上，可偶联尿酶测定血清或尿液中尿素含量，UV-LED法不受内源氨干扰，可辅助检测肾脏疾病，还可以测定支链氨基酸及测定血清中亮氨酸氨肽酶活性等。现有报道亮氨酸脱氢酶的生产方法为构建表达亮氨酸脱氢酶的大肠杆菌基因工程菌，基于亮氨酸脱氢酶在医药行业等方面的应用，对酶的安全性要求更高，有必要选择安全性更高表达宿主。相比大肠杆菌，B.subtilis具有不易形成包涵体、表达产物直接分泌到胞外，后期分离纯化便利等优点，有较好的工业生产应用基础。B.subtilis具有不易形成包涵体、表达产物直接分泌到胞外，后期分离纯化便利等优点，并且能从上游保证该酶生产的安全性，有较好的工业生产应用基础，并且目前还没有相关报道将亮氨酸脱氢酶在枯草芽孢杆菌中进行表达，因此，构建一种能够增加亮氨酸脱氢酶胞外分泌的枯草芽孢杆菌基因工程菌是有待研究的课题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种表达亮氨酸脱氢酶的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌是将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达载体上，然后在表达载体自身启动子和亮氨酸脱氢酶基因间加入信号肽序列，将构建的重组表达载体转化到枯草芽孢杆菌中，得到枯草芽孢杆菌重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶基因来源于Bacilluscereus。在本专利技术的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD。在本专利技术的一种实施方式中，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD，所述AmyQ的核苷酸序列SEQIDNO.2，所述SacB的核苷酸序列如SEQIDNO.3所述，所述PhoD的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pMA5。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis168或BacillussubtilisWB600。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的制备方法：将亮氨酸脱氢酶连接到表达载体上，然后在表达载体自身启动子和亮氨酸脱氢酶基因间加入信号肽序列。一种分泌亮氨酸脱氢酶枯草芽孢杆菌重组菌的构建方法，所述构建方法是：(1)将核苷酸序列如SEQIDNO.1的亮氨酸脱氢酶的基因与质粒pMA5进行连接，得到重组质粒pMA5-leudh；(2)将信号肽序列与重组质粒pMA5-leudh通过酶切位点相连，得到重组质粒pMA5-SPN-leudh；(3)将重组质粒pMA5-SPN-leudh转化枯草芽孢杆菌，得到枯草芽孢杆菌重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis168或BacillussubtilisWB600。在本专利技术的一种实施方式中，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD。在本专利技术的一种实施方式中，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD，所述AmyQ的核苷酸序列SEQIDNO.2，所述SacB的核苷酸序列如SEQIDNO.3所述，所述PhoD的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述信号肽序列为PhoD，所述PhoD的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术的第二个目的是提供一种发酵生产亮氨酸脱氢酶的方法，所述方法的具体步骤如下：(1)将枯草芽孢杆菌重组菌在LB培养基中，35-39℃振荡培养10-16h，作为一级种子发酵液；(2)将一级种子发酵液按照4-5％接种到发酵培养液，35-39℃振荡培养8-12h，作为二级种子发酵液；(3)将二级种子发酵液全部加入有发酵培养液的发酵罐中，在35-39℃，溶氧控制在25-35％条件下培养，全程用氨水以及磷酸进行pH值的调节，保持在6.8-7.2；待碳源耗尽，即DO值迅速上升时，进行补料。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖8-10g/L，蛋白胨10-12g/L，酵母粉22-24g/L，酵母浸膏8-10g/L，磷酸氢二钾11-12.54g/L，磷酸二氢钾2.00-2.31g/L，微量元素2-3ml，加入卡纳至75-100mg/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述补料配方为葡萄糖450-500g/L，酵母提取物65-75g/L。本专利技术的有益效果采用本专利技术的方法首次实现了亮氨酸脱氢酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，构建的重组菌Bacillussubtilis168/pMA5-SPN-leudh，通过信号肽的加入，促进了亮氨酸脱氢酶的分泌表达，提高了亮氨酸脱氢酶酶活。相比重组菌Bacillussubtilis168/pMA5–leudh，胞外亮氨酸脱氢酶酶活提高了2.2倍，亮氨酸脱氢酶的酶活力可达252.92U/mL。本专利技术采用的B.subtilis表达体系，具有非密码子偏爱性，不易形成包涵体、表达产物直接分泌到胞外，后期分离纯化便利等优点，该体系在表达亮氨酸脱氢酶过程中，能够将酶直接分泌到胞外，减小纯化成本，为工业生产亮氨酸脱氢酶提供新的思路。附图说明图1分泌表达载体pMA5-SPN-leudh构建示意图；图2含不同信号肽各重组菌SDS-PAGEM:ProteinMarker(Low)1:168/pMA52:168/pMALipB3:168/pMANprE4:168/pMAAmyQ5:168/pMASacB6:168/pMALipA7:168/pMAYwbN8:168/pMAPhoD；图3重组菌B.subtilis168/pMA5-SPPhoD-leudh7.5L发酵罐酶活曲线图。具体实施方式单位酶活定义：每分钟生成1umolNADH所需的酶量为一个酶活单位。。测定方法：反应体系3ml，在含20mM亮氨酸的0.2M甘氨酸-KCl-KOH(pH10.5)缓冲液中加入12.5mMNAD+溶液，37℃平衡5min后加入酶液摇匀，不加酶液为对照，340nm波长测定3min内吸光值变化。表1引物实施例1：含重组亮氨酸脱氢酶基因重组质粒的构建与表达以全基因合成的leudh为模板，引物F1/R1(C端引入6×His)进行PCR，引入酶切位点BamHI/MluI。分别对PCR产物、质粒pMA5双酶切，跑胶回收片段用T4DNA连接酶连接过夜，得到重组质粒pMA5-leudh。实施例2：融合不同信号肽的分泌表达质粒pMA5-SPN-leudh的构建提取B.subtilis168基因组DNA，以该基因组DNA为模板，通过引物LipA-F/LipA-R进行PCR反应，扩增得到序列如SEQIDNO.6的信号肽LipB，并在信号肽的N端和C端分别引入NdeI/BamHI位点，之后对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达亮氨酸脱氢酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将亮氨酸脱氢酶基因

【技术特征摘要】
1.一种表达亮氨酸脱氢酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达载体上，然后在表达载体自身启动子和亮氨酸脱氢酶基因间加入信号肽序列，将构建的重组表达载体转化到宿主枯草芽孢杆菌中，得到枯草芽孢杆菌重组菌。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶基因来源于Bacilluscereus。3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD。5.根据权利要求1或4所述的重组菌，其特征在于，所述信号肽序列为AmyQ、SacB和PhoD，所述AmyQ的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述SacB的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述PhoD的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。6.根据权利要求1所述的的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法如下：(1)将核苷酸序列如SEQIDNO.1的亮氨酸脱氢酶的基因与质粒pMA5进行连接，得到重组质粒pMA5-leudh；(2)将信号肽序列与重组质粒pMA5-leudh通过酶切位点相连，得到重组质粒pMA5-SPN-leudh；(3)将重组质粒pMA5-SPN-leudh转化枯草芽孢杆菌，得到枯草芽孢杆菌重组菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玲，杨海麟，王男，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32