一种同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一组引物和探针，其中引物包含SEQ ID NO：1‑4所示的核苷酸序列；探针包含SEQ ID NO：5‑8所示的核苷酸序列，每条探针的5'端和3'端都带荧光标记，且每条探针的5'端荧光标记均不一样。本发明专利技术还提供了所述引物和探针在一种四重荧光定量PCR检测方法中的应用，该方法在检测待测样品中是否含有H7N9病毒的同时鉴定其是否为高致病性H7N9突变病毒及其NA基因是否出现奥司他韦耐药突变。同时本发明专利技术还提供了含有该引物、探针的检测试剂盒。经实验证明，本发明专利技术的引物和探针特异性好、准确性高、检测时间短。基于该引物和探针建立的检测方法，能够快速、准确、简便的检测待测样本中是否含有H7N9病毒，同时鉴定样本中的H7N9病毒是否为高致病性H7N9突变病毒，其NA基因是否出现奥司他韦耐药突变。

A method and kit for simultaneous detection of H7N9 virus and its highly pathogenic H7 and drug-resistant N9 mutation

The present invention provides a set of primers and probes, in which the primers include the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO:1 4, and the probe contains the nucleotide sequence shown by the SEQ ID NO:5 3', each probe has a fluorescent labeling on the 5' end and 3'end of each probe, and the 5' terminal fluorescent labeling of each probe is not the same. The invention also provides the application of the primers and probes in a four heavy fluorescence quantitative PCR detection method, which is to detect whether the H7N9 virus is contained in the samples to be detected and whether it is a highly pathogenic H7N9 mutant virus and whether the NA gene appears to be an oseltamivir resistance mutation. Meanwhile, the invention also provides a detection kit containing the primer and probe. It is proved by experiments that the primers and probes of the invention have good specificity, high accuracy and short detection time. The detection method based on the primers and probes can quickly, accurately and easily detect whether the H7N9 virus is contained in the samples to be tested, and whether the H7N9 virus in the sample is a highly pathogenic H7N9 mutant virus, and whether the NA gene appears to be the oseltamivir resistance mutation.

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的方法及试剂盒
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的方法及试剂盒。
技术介绍
2013年，中国首次报道了人感染H7N9病毒。截止到目前，H7N9病毒在人群中已经出现了5次爆发流行。在第五波H7N9疫情中，研究者发现了一种高致病性H7N9突变病毒，该病毒血凝素HA蛋白的肽链接位置发生了插入性突变，使病毒具备了对禽类的高致病性特点。同时，在监测过程中研究者们也发现，在禽类和感染患者体内都出现了H7N9耐药毒株，其NA基因的292位氨基酸发生了R/K突变。这类毒株对奥司他韦（达菲）等临床上常用的神经氨酸酶类药物具有耐药性。高致病性H7N9突变病毒以及耐药病毒的出现不仅对人类健康造成了巨大威胁，也严重威胁我国的养殖业。尽管如此，目前还没有能够同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、稳定、简便和快速的同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的多重荧光定量PCR方法，本专利技术还提供了一组适用于该方法的特异性好、准确性高、检测时间短的引物和探针以及含有该引物和探针的试剂盒。本专利技术提供了一组引物和探针，所述引物包含SEQIDNO：1-4所示的核苷酸序列；所述探针包含SEQIDNO：5-8所示的核苷酸序列；在本专利技术中，所述特异性荧光探针的荧光组合优选为FAM-NFQ-MGB,VIC-NFQ-MGB,CY5-BHQ3和ROX-BHQ2。本专利技术提供了所述的引物和探针在制备一种同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的产品中的应用。所述产品包括本专利技术所述的引物和探针；荧光定量PCR扩增试剂；阳性对照和阴性对照。在本专利技术中，所述的荧光定量PCR试剂优选为来自Takara公司的货号为RR064A的OneStepPrimeScript™RT-PCRKit试剂盒所包含的试剂。在本专利技术中，所述的阳性对照优选为含有高致病性H7和耐药突变型N9目的基因片段的质粒；所述的阴性对照优选为无RNA酶的水。所述多重荧光定量PCR反应的反应体系优选如下：2×OneStepRT-PCRBufferⅢ:10μlTakaraExTaqHS:0.4μlPrimeScriptRTEnzymeMix:0.4μlH7-F：浓度为20μM:0.6μlH7-R：浓度为20μM:0.6μlH7-P-W:浓度为20μM:0.4μlH7-P-M:浓度为20μM:0.8μlN9-F:浓度为20μM:0.4μlN9-R:浓度为20μM:0.4μlN9-P-W:浓度为20μM:0.4μlN9-P-M:浓度为20μM:0.4μlDEPC水:0.8μl待测样本RNA：5μl；所述2×OneStepRT-PCRBufferⅢ、TakaraExTaqHS、PrimeScriptRTEnzymeMix均来自Takara公司的货号为RR064A的OneStepPrimeScript™RT-PCRKit试剂盒；在本专利技术中，所述荧光定量PCR反应的程序优选为：42℃5min;95℃10S;95℃5s,60℃30,40个循环。在本专利技术中，所述检测方法的检测结果判断标准如下：Ct<38判断为阳性；38<Ct<40为可疑，需重复试验进行检测，若重复检测一遍后结果仍在此范围内，则判断为阳性；Ct>40判断为阴性。本专利技术具有如下有益效果：（1）本专利技术针对高致病性H7N9突变病毒及其NA耐药突变设计的引物、探针特异性好、准确性高、检测时间短。（2）本专利技术建立的一种同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的多重荧光定量PCR检测方法，可对高致病性H7N9突变病毒及其NA耐药突变进行定性和定量检测。（3）本专利技术建立的一种同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的多重荧光定量PCR检测方法特别适用于临床样品以及禽类样本的检测，操作简易，结果稳定，通量高，对我国H7N9病毒防控工作具有重要的意义。附图说明图1：野生型H7N9病毒非耐药株（低致病性H7N9突变病毒，N9未出现292位耐药突变）检测结果；图2：野生型H7N9病毒耐药株（低致病性H7N9突变病毒，N9出现292位耐药突变）检测结果；图3：高致病性H7N9突变病毒非耐药株（高致病性H7N9突变病毒，N9未出现292位耐药突变）检测结果；图4：高致病性H7N9突变病毒耐药株（高致病性H7N9突变病毒，N9出现292位耐药突变）检测结果。具体实施方式除非特殊说明，本专利技术所用术语具有本专利技术所属领域中的一般含义。下面参考具体实施例和附图，对本专利技术进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1本实施例提供了一种同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的引物、探针及其应用。引物、探针的设计：通过对H7N9病毒的HA和NA基因进行比对，在高致病性H7以及耐药型N9突变区域上游和下游寻找保守序列，设计能够覆盖所有毒株的特异性引物和探针，以及能够特异性识别突变型H7和耐药型N9的探针。引物和探针具体序列如下：H7上游引物（H7-F）：5'-GGRAAATGYCCRAGATATGTTAA-3'（SEQIDNO.1）（Y代表T或C，R代表A或G）H7下游引物（H7-R）：5'-AATTAGKCCTTCCCATCCATTT-3'（SEQIDNO.2）（K代表G或T）通用型H7探针（H7-P-W）：5'-ROX-TTGGTGCYATAGCDGGTTTCATTGA-BHQ2-3'（SEQIDNO.3）(Y代表T或C，D代表A或G或T)突变型H7探针（H7-P-M）：5'-FAM-AGRGAAAACGGAYTGCGA-NFQ-MGB-3'(R代表A或G，Y代表T或C)N9上游引物（N9-F）：5'-GAAGAATGCTCATGTTACGG-3'N9下游引物（N9-R）：5'-TGACTAGTGTGTGTCATTGCTA-3'通用型N9探针（N9-P-W）：5'-CY5-ATTGGCAGGGCTCAAATAGACCAGT-BHQ3-3'耐药型N9探针（N9-P-M）:5'-VIC-GCACATGCAAGGACA-NFQ-MGB-3'上述引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成，扩增的目的片段大小为98/110bp（其中突变型H7为110bp，其余为98bp）。上述引物和探针可应用于制备检测高致病性H7N9突变病毒及其NA耐药突变的产品，所述检测产品还包括Takara公司货号为RR064A的OneStepPrimeScript™RT-PCRKit试剂盒中的试剂。实施例2本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：（1）实施例1的引物和探针；（2）荧光定量PCR扩增试剂。本专利技术中，所述荧光定量PCR试剂优选为Takara公司的货号为RR064A的OneStepPrimeScri本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组引物和探针，其特征在于，所述引物包含SEQ ID NO ：1‑4所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一组引物和探针，其特征在于，所述引物包含SEQIDNO：1-4所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针为包含SEQIDNO：5-8所示的核苷酸序列；在本发明中，所述荧光探针的荧光标记优选为：H7-P-W所用的荧光基团为ROX，淬灭基团为BHQ2；H7-P-M所用的荧光基团为FAM，淬灭基团为NFQ-MGB；N9-P-W所用的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ3；N9-P-M所用的荧光基团为VIC，淬灭基团为NFQ-MGB；根据权利要求1和2所述的引物和探针在制备一种同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的产品中的应用；在本发明中，所述一种同时检测H7N9病毒及其高致病性H7和耐药型N9突变的产品还包括荧光定量PCR扩增试剂；一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1和2所述的引物和探针。3.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括荧光定量PCR扩增试剂；在本发明中，所述荧光定量PCR试剂优选为来自Takara公司的货号为RR064A的OneStepPrimeScript™RT-PCRKit试剂盒所包含的试剂；在本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；在本发明中，阳性对照优选为含有高致病性H7和耐药突变型N9目的基因片段的质粒；所述的阴性对照优选为无RNA酶的水。4.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述多重荧光定量PCR反应的反应体...

【专利技术属性】
技术研发人员：高福，毕玉海，刘映霞，杨扬，郑海霞，李善琴，许智祥，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，深圳市第三人民医院深圳市肝病研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11