本发明专利技术公开了一种重金属汞人工抗原的制备方法，以2‑S‑(4‑氨基苯）‑1，4，7三氮杂环壬烷‑1，4，7‑三乙酸（p‑NH2‑Bn‑NOTA，简称NOTA）为螯合剂，将汞离子螯合剂复合物与载体蛋白牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA偶联，制备人工抗原，该方法在原来传统基础上增加了硼氢化钠处理步骤，提高了偶联效率与抗血清效价。本发明专利技术还公开了NOTA在制备重金属汞人工抗原试剂中的应用。
Preparation of a heavy metal mercury artificial antigen and application of NOTA in the preparation of heavy metal mercury artificial antigen reagent
The invention discloses a method for the preparation of a heavy metal mercury artificial antigen, which is a chelating agent with 2 S, 4, 7 three nitrogen heterocyclic nonane nonane 1, 4, 7 three acetic acid (P NH2 Bn NOTA, abbreviated as NOTA) as chelating agent, coupled with the carrier protein bovine serum albumin BSA or the chicken ovalbumin OVA, the complex of the mercury ion chelating agent. The artificial antigen was prepared by adding the sodium borohydride treatment process on the traditional basis, which improved the coupling efficiency and antiserum titer. The invention also discloses the application of NOTA in preparing heavy metal mercury artificial antigen reagent.
【技术实现步骤摘要】
一种重金属汞人工抗原的制备方法及NOTA在制备重金属汞人工抗原试剂中的应用
本专利技术属于重金属离子免疫化学
，具体涉及一种重金属汞人工抗原的制备方法及NOTA在制备重金属汞人工抗原试剂中的应用。
技术介绍
重金属污染主要指铅、镉、汞、镍、铬、砷、锌、铜等污染物对环境的污染。重金属分布广泛、难以降解，可通过大气、水、食物链进入人体，与体内蛋白质及各种酶发生作用，使它们失去活性，并在某些器官中富集，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性或慢性中毒，具有致癌、致畸及致突变作用，对人体具有很大的危害。因此，加强重金属在环境、农产品和食品中残留检测成为保障重金属安全的重要手段，而新形势下检测新技术的研究和开发显得尤为迫切，但是，不同的重金属由于其属性不同，处理的方式也不完全相同，例如，重金属汞是一种剧毒性元素，微量的汞即能产生很大的毒性，因此，对于汞元素的处理是否彻底和完全显得尤为重要。传统的重金属检测方法主要采用原子吸收光谱分析(AtomicAbsorptionSpectroscopy，AAS)、电感耦合等离子发射光谱(InductiveLyCoupLedpLasmaAtomicEmissionSpectroscopy，ICP-AES)、阳极溶出伏安法(AnodicStrippingVoLtammetry，ASV)、色谱法和各种联用检测方法。这些方法虽然能对各种环境样品中的重金属离子进行有效分析，但大多需要大型仪器，分析方法成本高，样品需要经过消解，分析时间长，不适于重金属的现场快速检测，难以适应环境及市场产品的现场抽查、生产企业自查及产品进出口快速通关的要求。免疫学检测技术具有检测速度快、分析容量大、费用低廉、仪器简单易携、使用人员技术要求不高，容易普及和推广、灵敏度高和选择性强等优点，尤其适合现场筛选和大量样品的快速分析，已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。以该技术为基础开发的一系列检测产品，如ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、免疫传感器等已广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。重金属离子免疫检测的关键在于抗重金属特异性抗体的制备，而特异性抗体制备的关键又在于优质重金属免疫原的合成。一方面，由于重金属离子带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆反应，引起动物中毒反应；另一方面，重金属的分子量低，不具有免疫原性，需将它与载体蛋白偶联，才能形成完整的免疫原，但是由于重金属离子直接与蛋白连接，会使蛋白质变性，因此，需利用双功能螯合剂螯合重金属离子，制备金属-螯合剂复合物，将该复合物再与蛋白偶联后制备完全抗原，进而免疫动物制备特异性抗体。采取的是一种开环式的双功能螯合剂进行螯合，后再与载体蛋白偶联制备人工抗原进行动物免疫和抗体的制备，在此基础上建立不同的免疫分析技术和方法。制备重金属免疫原的关键在于双功能螯合剂的选择，目前常用的双功能螯合剂主要是乙二胺四乙酸(ethyLenediamietetraaceticacid，EDTA)或二乙烯三胺五乙酸(diethyLenetriaminepenLaaceticacid，DTPA)的衍生物及其他具有螯合功能的结构类似物，属于链式开环结构的螯合剂，螯合物是由中心离子和多齿配体结合而成的具有环状结构的配合物。例如，EDTA与金属离子通过羧酸基和氮原子键合而形成比络合物更稳定的金属-EDTA螯合物，而双功能螯合剂应具有两个作用，除了能特异性螯合重金属离子之外，还能与载体蛋白偶联，形成免疫原，用于后续免疫动物、制备抗体。这些常规的螯合剂由于是开环式和直链型的结构，重金属离子和螯合剂的复合物作为抗原识别位点在空间结构上比较简单，特征官能团特征不强，导致所制备的抗原决定簇抗原特性不强，直接影响高特异性和高灵敏度抗体的制备效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种重金属汞人工抗原的制备方法。制备的重金属汞人工抗原免疫动物后得到的抗体亲和力高，特异性强，抗血清效价高。新型双功能螯合剂2-S-(4-氨基苯)-1，4，7三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(p-NH2-Bn-NOTA，简称NOTA)具有三氮闭环结构特征，能更好的结合重金属离子，并且在空间结构上能更好的将重金属汞离子的复合三维结构展现出来作为抗原决定簇，抗原特征更明显，有利于制备亲和力更高、特异性更强的重金属单克隆和多克隆抗体，并且戊二醛法将氨基半抗原与载体蛋白偶联，加入丙二酸二乙酯，使生成的重金属汞人工抗原更加稳定，抗血清效价高。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种重金属汞人工抗原的制备方法，包括以下步骤：称取5-8mg2-S-(4-氨基苯)-1，4，7三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(p-NH2-Bn-NOTA，简称NOTA)，溶解于2mL0.01M、pH7.44-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液，制得NOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；称取121.73mg硝酸汞溶解于5mL超纯水中，制得浓度为7.5×10-2M的硝酸汞溶液，此溶液为B液；将150-200μL的B液加入到A液中，室温下避光反应3-5h，此反应液为C液；向C液中逐滴加入500-800μL，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；称取20-30mg牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA溶解于3mLHEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应液为E液；将D液逐滴加入到E液中，室温下避光反应24h，后加入150-200μL硼氢化钠溶液(20mg溶解于200μl超纯水中)，室温下避光反应1h；反应液先用8KD的透析袋透析3-5次，再用30KD的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用5-10mL的0.01M，pH7.4的HEPES溶液复溶，后分装，-20℃低温保存，制得重金属汞人工抗原。人工抗原的鉴定：采取紫外扫描和SDS-PAGE鉴定其偶联效果，采用ICP-MS法和Bradford法测定重金属离子和蛋白浓度计算人工抗原的偶联结合比。本专利技术重金属汞人工抗原的制备方法选用双功能螯合剂NOTA，能更好的结合重金属离子，作为抗原决定簇，制备的重金属单克隆和多克隆抗体亲和力高，特异性强，并且在戊二醛法偶联后中加入丙二酸二乙酯，制备的重金属汞人工抗原更加稳定，抗血清效价高。附图说明图1Hg-NOTA-BSA和Hg-NOTA-OVA紫外扫描图谱。图2Hg-NOTA-BSA和Hg-NOTA-OVA电泳图谱。图3NOTA、DTPA和EDTA的结构图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案、技术效果更加清楚明白，通过以下实施例对本专利技术进行进一步详细说明。以下对于具体实施方案的描述仅用于解释本专利技术，并不限定本专利技术。实施例1称取7mgNOTA，溶解于2ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液(0.01M，pH7.4)，制备成NOTA螯合剂溶液，此反应液为A液；称取121.73mg硝酸汞溶解于5ml超纯水中，制备成7.5×10-2M的硝酸汞溶液，此反应液为B液；吸取180μl的B液逐滴加入到A液中，室温下避光反应3h，此反应液为C液；向C液中逐滴加入700μl，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；称取20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4mlHEPES，室温下磁力搅拌混匀，此反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重金属汞人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：称取5‑8 mg 2‑S‑(4‑氨基苯）‑1，4，7三氮杂环壬烷‑1，4，7‑三乙酸（p‑NH2‑Bn‑NOTA，简称NOTA），溶解于2 mL 0.01 M、pH7.4 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液，制得NOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；称取121.73mg硝酸汞溶解于5 mL超纯水中，制得浓度为7.5×10
【技术特征摘要】
1.一种重金属汞人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：称取5-8mg2-S-(4-氨基苯）-1，4，7三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸（p-NH2-Bn-NOTA，简称NOTA），溶解于2mL0.01M、pH7.44-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液，制得NOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；称取121.73mg硝酸汞溶解于5mL超纯水中，制得浓度为7.5×10-2M的硝酸汞溶液，此溶液为B液；将150-200μL的B液加入到A液中，室温下避光反应3-5h，此反应液为C液；向C液中逐滴加入500-800μL，20mM的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此反应液为D液；称取2...
【专利技术属性】
技术研发人员：金仁耀，郭建军，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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