治疗性细胞内化缀合物制造技术

本文提供了细胞穿透缀合物。缀合物包括非细胞穿透蛋白、硫代磷酸酯核酸、将硫代磷酸酯核酸连接至非细胞穿透蛋白的第一接头和将硫代磷酸酯核酸连接至治疗性部分(例如siRNA或小分子)的第二接头，其中硫代磷酸酯核酸增强非细胞穿透蛋白的细胞内递送。本文提供的缀合物尤其可用于治疗癌症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗性细胞内化缀合物相关申请的交叉引用本申请要求于2015年8月6日提交的美国临时申请No.62/201,993的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本文。关于联邦政府赞助的研究和开发所获得的专利技术的权利的声明本专利技术使用由国立卫生研究院授予的资助号CA122976的资助获得。政府对专利技术享有一定的权利。专利技术背景在过去的二十年中，使用治疗性单克隆抗体(TMA)治疗癌症在其分子复杂性和临床功效方面均有所改进。开发有效的TMA的最初努力主要集中于(i)将抗体蛋白质人源化以克服与免疫原性有关的问题，和(ii)扩展靶抗原库。同时开发了抗体-药物缀合物(ADC)，用于靶向递送有效的抗癌药物以避免常规化疗法引起的常见并发症。尽管两个领域都取得了进展，但是TMA和ADC仍然存在与例如癌细胞特异性、缀合化学、肿瘤渗透、产品异质性和制造问题有关的限制。本文提供的组合物和方法解决了本领域中的上述及其他缺陷。专利技术概述第一方面，提供了细胞穿透缀合物。所述细胞穿透缀合物包括：(i)非细胞穿透蛋白，(ii)硫代磷酸酯核酸，(iii)将所述硫代磷酸酯核酸连接至所述非细胞穿透蛋白的第一接头，和(iv)将所述硫代磷酸酯核酸连接至治疗性部分的第二接头，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。另一方面，提供了形成细胞穿透缀合物的方法。所述方法包括：(i)使非细胞穿透蛋白与第一硫代磷酸酯核酸接触，其中所述非细胞穿透蛋白连接至第一生物素结合对的第一成员，且所述第一硫代磷酸酯核酸连接至第一生物素结合对的第二成员，由此形成包含第一生物素结构域和第一生物素结合结构域之间的非共价键的第一缀合物。(ii)使治疗性部分与第二硫代磷酸酯核酸接触，由此形成第二缀合物。并且(iii)将第一硫代磷酸酯核酸与第二硫代磷酸酯核酸杂交，由此形成细胞穿透缀合物。另一方面，提供了形成细胞穿透缀合物的方法。该方法包括：(i)使硫代磷酸酯核酸与治疗性部分接触，由此形成第一缀合物。(ii)使所述第一缀合物与非细胞穿透蛋白接触，其中所述非细胞穿透蛋白连接至生物素结合对的第一成员，并且所述第一缀合物连接至生物素结合对的第二成员，由此形成包含生物素结构域和生物素结合结构域之间的非共价键的细胞穿透缀合物。另一方面，提供了包含本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)的细胞。另一方面，提供了包含本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)和药学上可接受的载体的药物组合物。另一方面，提供了将非细胞穿透蛋白递送至细胞中的方法，包括使细胞与本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)接触。另一方面，提供了将治疗性部分递送到细胞中的方法，包括使细胞与本文提供的细胞穿透性缀合物(包括其实施方案)接触。另一方面，提供了治疗有需要的对象中的疾病的方法。该方法包括给对象施用有效量的本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)，由此治疗对象中的疾病。附图说明图1：细胞内化ADC的凝胶纯化。当经修饰的抗体和经修饰的药物的杂交完成后，对ADC进行凝胶过滤并将含有1.IgG蛋白质、2.DNA和3.荧光基团的三重阳性级分视为完整ADC，并因此收集用于进一步基于细胞的分析。图2A和2B：通过细胞内化ADC识别肿瘤细胞。将人PSMA(前列腺特异性膜抗原)+LNCaP(前列腺腺癌)细胞分别与非内化抗-PSMA-PO(磷酸酯)-ds(双链)DNA-DM1或内化抗-PSMA-PS(硫代磷酸酯)-dsDNA-DM1孵育4小时。(图2A)流式细胞术分析显示细胞内化ADC的识别。(图2B)人PSMA和LNCaP的共聚焦显微镜分析显示用抗-PSMA-PO-dsDNA-DM1处理后在表面积聚但未发生细胞内化。由于高细胞毒性和肿瘤细胞杀伤，抗-PSMA-PS-dsDNA-DM1的细胞定位成像失败。图3A和3B：通过修饰的抗体-药物缀合物的内化诱导的肿瘤细胞死亡。将人PSMA和LNCaP细胞与所标明的非内化抗-PSMA-PO-dsDNA-DM1或内化抗-PSMA-PS-dsDNA-DM1分别孵育4小时。(图3A)流式细胞术分析显示内化抗-PSMA-PS-dsDNA-DM1处理有效诱导AnnexinV+肿瘤细胞的凋亡(当它们内化该构建体时)。(图3B)通过流式细胞术检测的用于确定细胞内化抗-PSMA-PS-dsDNA-DM1诱导的绝对肿瘤细胞凋亡的整体分析。图4：siRNA肿瘤抗原靶向性递送的设计。前列腺癌特异性抗-PSMA通过硫代磷酸酯化的ssDNA接头与STAT3siRNA融合。组分：(i)PSMA-抗生物素蛋白和(ii)PS-ssDNA/siRNA-生物素和如所示的具体功能。图5A和5B：缀合物抗-PSMA-PS-ssDNA-RNAi的纯化和分析。对所示缀合物进行凝胶过滤并收集三重阳性级分用于进一步的体外分析。分析缀合物的PSMA-IgG蛋白质含量、硫代磷酸酯化的ssDNA含量和掺入ssDNA接头中的报道荧光基团(荧光素)。图6A和5B：缀合物抗-PSMA-PS-ssDNA-RNAi的细胞摄取和细胞内定位。(图6A)所示缀合物与人前列腺癌LNCaP细胞孵育并测定摄取(图6A，上图)。此外，通过用未标记的抗-PSMA抗体同时阻断表面PSMA蛋白，影响PSMA特异性摄取抗-PSMA-PS-ssDNA-STAT3siRNA(图6A，下图)。(图6B)将所示缀合物与人前列腺癌LNCaP细胞孵育，通过共聚焦显微镜检测抗-PSMA-PS-ssDNA-RNAi中的人抗-PSMA和荧光标记的PS-ssDNA在细胞内的共定位。比例尺，20μm。图7：抗-PSMA-PS-ssDNA-STAT3siRNA缀合物在体外发挥敲低作用。将人前列腺癌LNCaP细胞与所示缀合物孵育48小时，然后通过RT-PCR评估STAT3mRNA的表达。图8A和8B：细胞穿透PSMA-ADC在体外诱导肿瘤细胞凋亡。ADC-FM(由PS修饰的PSMA-ADC)内化至LNCaP细胞中并在体外诱导细胞凋亡。图8A免疫细胞化学检测PSMA-DM1647(未修饰的PSMA-ADC)和(PS修饰的)PSMA-DM1-FM495的细胞内化。将LNCaP细胞与10μg/ml用荧光基团缀合的ADC各合并的级分B1-3于37℃孵育30分钟，随后用Hoechst复染法对PSMA进行染色。比例尺为20μm。显示了几个类似结果的一个代表性图像。对PSMA-DM1647(ADC)和PSMA-DM1-FM495(ADC-FM)的合并级分B1-3(图8B)或单个ADC级分B1至B3和ADC-FM级分B1至B5进行流式细胞凋亡测定。图9A和9B：PS修饰的抗-PSMA-ADC-在体外的有效细胞穿透活性。ADC2-FM以温度依赖的方式内化至LNCaP细胞中。图9A温度依赖性ADC内化的流式细胞术分析。将LNCaP细胞与5μg/ml的ADC2或ADC2-FM在冰上孵育60分钟以使抗体结合，洗涤并移至4℃或37℃孵育不同时长。对表面结合的IgG染色并通过流式细胞术分析。37℃样品表面IgG染色的MFI信号除以4℃样品的IgG信号以百分比(MFI(FL4-A::IgG)的百分比)作图于Y轴，针对表示不同时间点(左)的X轴。类似地，计算了与4℃样品相比，来自37℃样品ADC2-FM偶联的荧光基团的M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞穿透缀合物，其包含：(i)非细胞穿透蛋白；(ii)硫代磷酸酯核酸；(iii)将所述硫代磷酸酯核酸连接至所述非细胞穿透蛋白的第一接头；和(iv)将所述硫代磷酸酯核酸连接至治疗部分的第二接头，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.06 US 62/201,9931.一种细胞穿透缀合物，其包含：(i)非细胞穿透蛋白；(ii)硫代磷酸酯核酸；(iii)将所述硫代磷酸酯核酸连接至所述非细胞穿透蛋白的第一接头；和(iv)将所述硫代磷酸酯核酸连接至治疗部分的第二接头，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。2.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述第一接头包含与第一生物素结构域非共价连接的第一生物素结合结构域。3.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结合结构域是第一抗生物素蛋白结构域。4.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结合结构域是第一链霉抗生物素蛋白结构域。5.权利要求4的细胞穿透缀合物，其中所述第一链霉抗生物素蛋白结构域结合多个第一生物素结构域。6.权利要求5的细胞穿透缀合物，其中所述第一链霉抗生物素蛋白结构域结合约四个第一生物素结构域。7.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结合结构域共价连接至所述非细胞穿透蛋白。8.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中多个第一生物素结合结构域连接至所述非细胞穿透蛋白。9.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结构域连接于所述硫代磷酸酯核酸。10.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中所述第一生物素结构域共价连接至所述硫代磷酸酯核酸。11.权利要求2的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸酯核酸连接至所述第一生物素结构域。12.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述第一接头或所述第二接头是共价接头。13.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述第二接头是共价接头。14.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述第二接头包含与第二生物素结构域非共价连接的第二生物素结合结构域。15.权利要求14的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结合结构域是第二抗生物素蛋白结构域。16.权利要求14的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结合结构域是第二链霉抗生物素蛋白结构域。17.权利要求16的细胞穿透缀合物，其中所述第二链霉抗生物素蛋白结构域结合多个第二生物素结构域。18.权利要求16的细胞穿透缀合物，其中所述第二链霉抗生物素蛋白结构域结合约四个第二生物素结构域。19.权利要求14的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结合结构域共价连接至所述治疗部分。20.权利要求19的细胞穿透缀合物，其中多个第二生物素结合结构域连接至所述治疗部分。21.权利要求14的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结构域连接至所述硫代磷酸酯核酸。22.权利要求21的细胞穿透缀合物，其中所述第二生物素结构域共价连接至所述硫代磷酸酯核酸。23.权利要求22的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸酯核酸连接至所述第二生物素结构域。24.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸是双链硫代磷酸酯核酸。25.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸是单链硫代磷酸酯核酸。26.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸的长度为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个核酸残基。27.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸的长度为约10至约30个核酸残基。28.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸的长度为约20个核酸残基。29.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有大于25kD的分子量。30.权利要求29的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有约25kD至约750kD的分子量。31.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白是抗体。32.权利要求31的细胞穿透缀合物，其中所述抗体是Ig...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·于，A·赫尔曼，
申请(专利权)人：希望之城，
类型：发明
国别省市：美国,US