包含同时表达IL-12和shVEGF的腺病毒的抗肿瘤免疫力增强组合物制造技术

本发明专利技术涉及同时表达白细胞介素‑12和shVEGF的溶瘤腺病毒，以及各自包含所述溶瘤腺病毒的抗肿瘤免疫增强组合物和抗癌作用促进组合物。本发明专利技术人在免疫学小鼠黑素瘤或肾癌模型中证实，VEGF抑制和IL‑12表达的同时发生诱导了免疫功能的恢复和对抗癌作用的促进。尤其是，通过发现了增强的抗癌作用涉及抗癌免疫力的提高、Th1细胞因子的增加以及肿瘤诱导的胸腺萎缩的预防，首次确立了同时表达IL‑2和shVEGF的基因载体在癌症基因治疗中的适用性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含同时表达IL-12和shVEGF的腺病毒的抗肿瘤免疫力增强组合物
本专利技术涉及用于增强抗肿瘤免疫力的包含共表达IL-12和shVEGF的腺病毒的组合物。
技术介绍
癌症患者中的免疫功能障碍是公知的[1]，临床上明显的是肿瘤有效地避免了抗癌免疫应答。虽然最近的抗癌治疗主要集中在外科手术、化学治疗和放射治疗，但它们都伴随有副作用[2,3]。为了克服这些障碍并提高抗癌治疗的效率，对免疫治疗的研究正在积极进行。在过去的几十年中，由于基础免疫学中的新发现和肿瘤抗原的分子发现，对用于预防和治疗癌症的免疫治疗的研究正在积极进行[4]。肿瘤细胞本身表达大量异常抗原，并且这些抗原通过免疫监视(immunesurveillance)引起根除应答(eradication)。即使体内的免疫系统积极作用，肿瘤细胞也可以避开免疫监视[5,6]。鉴定出这种现象是由肿瘤细胞产生的多种因子(factor)介导的。肿瘤组织可以产生免疫抑制分子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤生长因子(TGF)-β和白细胞介素(IL)-10[7,8]。据报道，在免疫抑制的肿瘤中发生调节性T细胞的浸润[9-11]。这些在肿瘤组织中过表达的因子诱导免疫抑制微环境和肿瘤中的免疫耐受(immunetolerance)。因此，克服免疫监视是免疫治疗的关键策略。IL-12是最有效和最有希望的抗癌细胞因子之一。IL-12是包含通过二硫键连接的40kDa和35kDa亚基的异二聚体(heterodimeric)蛋白，由活化的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和活性B淋巴细胞产生。IL-12可增强T辅助1(Th1)细胞免疫力[12]和细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性，并抑制血管生成。通常，IL-12激活T细胞和自然杀伤(NK)细胞的IFN-γ产生[13]。IL-12的局部表达允许肿瘤细胞灵敏地响应T细胞介导的细胞毒性，导致肿瘤生长抑制和全身免疫力(systemicimmunity)的建立。然而，临床应用IL-12的一个缺点是可能会在全身出现细胞因子相关毒性，其限制了当施用时对于患者的可接受剂量[14-17]。此外，免疫效应的整体下调可导致反复施用IL-12。在患者血清中，由于IL-10表达的升高和IFN-γ和TNF-β表达的降低，发生IL-12从Th1到Th2免疫的极化，并且由于该原因，IL-12被反复施用[18,19]。这些临床结果显示了IL-12作为用于癌症治疗的单一治疗剂的局限性。VEGF是由细胞产生的信号蛋白，刺激血管发生和血管生成[20]。特别是，VEGF影响骨髓中的T细胞前体，因此抑制T细胞和树突状细胞的增殖和成熟[21]。另外，VEGF在血管生成中发挥重要作用，并且代表了称为转移的副作用[22]。因此，VEGF是肿瘤生长的刺激因子，也充当了抗癌免疫力的抑制因子，预期由VEGFshRNA引起的VEGF下调可以恢复免疫应答并提高抗癌作用。这些研究表明与IL-12类似，由VEGFshRNA介导的治疗机制与增强的CTL或树突状细胞介导的免疫应答相关。因此，本专利技术人提出了使用上述免疫治疗的组合来更有效地提高抗肿瘤免疫力的方法。在整个说明书中引用了多篇论文和专利文献，并且指出了它们的引用。为了更清楚地描述本专利技术所属领域的标准和本专利技术的范围，引用的论文和专利文献的公开内容通过引用整体并入本文。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术人尝试开发免疫治疗以克服肿瘤使用肿瘤组织中产生的免疫抑制分子所进行的对免疫监视的逃避。结果，本专利技术人构建了共表达IL-12和shVEGF的腺病毒，并开发了包含腺病毒的用于改善免疫力的组合物和用于改善抗癌作用的组合物。此外，本专利技术人确定了通过将这种共表达IL-12和shVEGF的腺病毒(RdB/IL12/shVEGF)应用于癌症治疗可以增强治疗效果，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术旨在提供共表达IL-12和shVEGF的腺病毒和包含腺病毒的用于增强抗肿瘤免疫力的组合物。本专利技术还旨在提供共表达IL-12和shVEGF的腺病毒用于增强抗肿瘤免疫力的用途。本专利技术还旨在提供用于使用共表达IL-12和shVEGF的腺病毒增强抗肿瘤免疫力的方法。本专利技术还旨在提供包含共表达IL-12和shVEGF的腺病毒的抗癌组合物，其用于治疗癌症的用途以及用于治疗癌症的方法，所述方法包括向对象施用所述组合物。本专利技术还旨在提供用于预防或治疗肿瘤诱导的胸腺萎缩的组合物，所述组合物包含共表达IL-12和shVEGF的腺病毒，其用于治疗肿瘤诱导的胸腺萎缩的用途，以及用于治疗肿瘤诱导的胸腺萎缩的方法，所述方法包括向对象施用所述组合物。通过以下的专利技术详述、权利要求和附图，本专利技术的其他目的和优点将变得更加明显。[技术方案]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了：重组腺病毒，其包含(i)具有SEQIDNO：1的序列和SEQIDNO：2的序列中的至少一个的IL(interleukin)-12基因，以及(ii)与具有SEQIDNO：3的序列的VEGF(vascularendothelialgrowthfactor)mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；或者用于增强抗肿瘤免疫力(antitumorimmunity)的组合物，其包含：(a)治疗有效量的重组腺病毒；以及(b)可药用载体。在进行研究以开发免疫治疗来克服肿瘤使用肿瘤组织中产生的免疫抑制分子进行的对免疫监视的逃避中，本专利技术人构建了共表达IL-12和shVEGF的腺病毒，并开发了用于增强抗肿瘤免疫力的组合物和用于增强抗癌作用的组合物。本专利技术人确定了通过将这种共表达IL-12和shVEGF的腺病毒(RdB/IL12/shVEGF)应用于癌症的基因治疗可以改善治疗效果。在过去的几十年里，癌症免疫原性疗法已经发展成为一种更有前途的方法。但是，为了逃避免疫监视系统，肿瘤还具有多种不同的策略。为了克服这些障碍并提高抗癌免疫效果，构建了共表达IL-12(RdB/IL12)和VEGFshRNA(shorthairpinRNA)的系统(RdB/shVEGF)及其溶瘤性共表达腺病毒(RdB/IL12/shVEGF)系统，作为用于恢复免疫抑制并且提高抗癌免疫力的适当的治疗佐剂(adjuvant)。IL-12诱导Th1细胞分化并激活细胞毒性T淋巴细胞以及NK细胞的细胞毒性，从而提高抗癌免疫力。shVEGF对抑制VEGF表达非常有效，因此刺激T细胞和树突状细胞的增殖和成熟。这种效应进一步放大了IL-12的功能。然而，目前还没有关于肿瘤中由IL-2和shVEGF的共表达引起的治疗效果的研究。因此，本专利技术人首先研究了将共表达IL-2和shVEGF的腺病毒(RdB/IL12/shVEGF)注射到肿瘤中的免疫原性疗法的效果。在B16-F10鼠黑素瘤模型中，将RdB/IL12/shVEGF注射到肿瘤中极大地改善了抗癌作用。尽管在RdB/IL12/shVEGF处理组中IL-12和IFN-γ表达水平显著升高，但VEGF表达水平降低。另外，在脾细胞(splenocyte)和B16-F10共培养上清液中，T辅助细胞1/2型细胞因子的比率升高。在RdB/IL12/shVEGF注射小鼠中，癌症特异性免疫细胞的细胞毒性升高。像上述结果一样，RdB/IL12/sh本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺病毒，其包含：(i)具有SEQ ID NO：1的序列和SEQ ID NO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL‑12)基因，以及(ii)与具有SEQ ID NO：3的序列的VEGF mRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.01 KR 10-2015-01236441.一种重组腺病毒，其包含：(i)具有SEQIDNO：1的序列和SEQIDNO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL-12)基因，以及(ii)与具有SEQIDNO：3的序列的VEGFmRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因。2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述IL-12基因和所述shVEGF基因分别插入在所述腺病毒的E1区和E3区。3.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒具有E1A区，但不具有E1B区，其为缺失的。4.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述IL-12基因包含IL-12A(p35)基因序列、内部核糖体进入位点(IRES)序列和IL-12B(p40)基因序列。5.一种用于增强抗肿瘤免疫力的组合物，其包含：(a)治疗有效量的重组腺病毒，所述重组腺病毒包含(i)具有SEQIDNO：1的序列和SEQIDNO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL-12)基因，以及(ii)与具有SEQIDNO：3的序列的VEGFmRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；以及(b)可药用载体。6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述用于增强抗肿瘤免疫力的组合物是瘤内施用的。7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物提高肿瘤中的Th1/Th2细胞因子比率。8.一种抗癌组合物，其包含：(a)治疗有效量的重组腺病毒，所述重组腺病毒包含(i)具有SEQIDNO：1的序列和SEQIDNO：2的序列中的至少一个的白细胞介素(IL-12)基因，以及(ii)与具有SEQIDNO：3的序列的VEGFmRNA互补并抑制VEGF基因表达的小发夹RNA(shRNA)基因；以及(b)可药用载体。9.根据权利要求8所述的抗癌组合物，其中所述癌症为胃癌、肺癌、乳腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹彩钰，安孝敏，
申请(专利权)人：汉阳大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR