保存核糖核酸生物活性的方法技术

本发明专利技术提供了一种基本上保留或以其他的方式保存存在于细胞裂解物中的dsRNA的生物活性,以转录后沉默在靶生物体中的基因表达的方法，该方法包括向该裂解物中添加具有蛋白质‑或胺‑交联剂功能的化合物的步骤。本发明专利技术还包括组合物，该组合物包含裂解物，该裂解物包含dsRNA、和蛋白质交联剂，连同所述试剂在该方法中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】保存核糖核酸生物活性的方法本专利技术涉及通过双链RNA控制基因表达。具体而言，本专利技术涉及增强外源性-即在靶生物体外部并且在相对苛刻的环境条件下-施用的双链RNA以沉默该生物体中的基因表达的方法。本专利技术还涉及用于该方法的组合物，以及在该方法中的特定已知交联剂的用途。潜在沉默基因表达的RNA干扰现象是熟知的。RNA相对不稳定并且可以通过例如普遍存在于细胞外的核糖核酸酶迅速降解。将dsRNA直接应用于靶生物体，抑或经由外源性施用至它们存在的位置的问题在于RNA的稳定性差。外源性应用意指以生物体可将其并入其中的方式应用于靶生物体，或者dsRNA在与靶生物体不同的第一生物体中产生并且靶生物体并入第一生物体或其包含dsRNA的部分，使得所述dsRNA能够实现包含对应于由dsRNA包含的核苷酸序列的核苷酸序列的基因的转录后沉默。外源性应用与内源性产生(产生是指能够在转录后沉默靶向基因的双链RNA的靶生物体的细胞中产生(通常经由从适当的异源序列表达))不同。尽管外源施用的dsRNA通常能够在短期内，可能甚至在施用后多至几天内施加相关的生物效应，但该效应一般迅速下降，因为dsRNA在例如土壤中典型地具有仅约12小时至24小时的半衰期，并且还要进一步取决于其施用的精确环境条件。已经提出了对这个问题的不同解决方案，包括通过封装或以其他的方式将其结合到增强其稳定性的聚合物上来稳定dsRNA，从而提供增加的作用持续时间。效应的持续时间有2个方面。基因沉默本身将终止，取决于相关蛋白质的周转率。在环境条件下与土壤孵育时，dsRNA在约2天的时段内降解。虽然dsRNA可能具有基本上比此更长的效应-本专利技术的优点是增加了dsRNA在环境中的持久性。因此，本专利技术涉及解决dsRNA相对快速失活的问题的解决方案，所述dsRNA典型地在通常是有助于其快速降解或失活的田间条件下外源施用于生物体。根据本专利技术，提供了一种基本上保留或以其他的方式保存存在于细胞裂解物中的dsRNA的生物活性以转录后沉默在靶生物体中的基因表达的方法，该方法包括向裂解物中添加具有蛋白质-或胺-交联剂功能的化合物的步骤。“裂解物”简单地是指细胞裂解的产物。然而，尽管优选，裂解可能不一定是100％的，也就是说裂解物可能不包含所有细胞的裂解产物。另一方面，裂解也并不意味着裂解物包含仅仅相对较少的细胞的裂解产物，例如说小于10％的细胞的裂解产物。因此，技术人员将认识到即使其包含相对低百分比的基本上完整的细胞，裂解物仍是裂解物。典型地通过机械降解或剪切细胞产生细胞裂解物，尽管它们也可以作为细胞失活过程的一部分产生，如当例如通过巴氏灭菌或涉及加热或化学失活的一些其他过程使细菌细胞失活时典型地所发生的。可以在裂解物形成时将试剂添加到细胞中-即作为形成裂解物的过程的一部分，或在裂解物形成后添加到裂解物中。可替代地，可以将试剂添加到裂解物施用的位置。位置是指任选包含所述试剂的裂解物被施用的位置，并且包括其中植物正在生长的田间，或其中播种了栽培植物的种子的田间，或者将放置所此类种子或植物的土壤，或者实际上是田间、土壤、种子和/或植物本身。可能在施用裂解物之前，将药剂添加到所述位置。在该方法的一个优选实施例中，所述位置是土壤，并且将该组合物在植物附近施用于其上，以期望通过将dsRNA靶向昆虫有害生物例如玉米根虫中的必需基因对其进行保护。交联剂可选自下组，该组由以下组成：聚醛、二醛、二环氧化物、聚环氧化物、吡啶基二硫化物、碳二亚胺、二异氰酸酯或聚异氰酸酯、多官能马来酰亚胺、二亚氨酸酯或聚亚氨酸酯、双重氮、n-羟基琥珀酰亚胺酯和卤代缩醛以及事实上任何其他已知的包含至少两个官能团的交联剂-这些官能团可以相同抑或不同。一些交联剂略微可溶于水，在这种情况下，它们可以方便地用于在适合溶剂或在水和此类溶剂的混合物中的溶液。更优选地，该试剂选自下组，该组由以下组成：聚醛和二醛，并且仍更优选二醛。最特别优选的二醛是戊二醛，其具体用途在本专利技术方法中示例如下。戊二醛是优选的，因为其反应性使得反应方便快捷，但不会太快以至于难以处理。它相对无毒，方便地溶于水，容易获得且价格便宜。在该方法的一个具体实施例中，形成裂解物的细胞是细菌细胞，尽管其他细胞可以是裂解物的来源，包括藻类和甚至植物或其他的真核细胞。如上所述，在细胞是细菌细胞的情况下，裂解物可能-至少在某种程度上-作为使细胞失活的过程的后果产生。本领域已知不同失活过程，包括通过加热失活(在温度和持续时间变化极大的条件下)，通过过乙酸、抗坏血酸铜、次氯酸钠、过氧化氢、硫氰酸胍、甲醛和其他的单-醛等的化学失活，和使其经受电离辐射。无论使用何种过程，如上所述的裂解物可以包含一些基本上完整的细菌，不包含任何有生物活力的细菌。因此，可以将裂解物制备作为细菌细胞的失活过程的一部分，或者细胞可以基本失活，但也基本上完整并且裂解物随后由其产生。产生裂解物的细胞无论它们是原核的还是真核的都被工程化以包含DNA序列，所述DNA序列在转录时产生双链RNA，其至少一部分包含与以下序列基本上相同的序列：例如真核细胞中基因的mRNA，特别是植物有害生物例如昆虫的细胞中的基因的mRNA。此类昆虫有害生物的典型实例包括西方玉米根萤叶甲(Diabroticavirgiferavirgifera(西方玉米根虫))、巴氏根萤叶甲(Diabroticabarberi(北方玉米根虫))、黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctatahowardi(南方玉米根虫))、墨西哥玉米根萤叶甲(Diabroticavirgiferazeae(墨西哥玉米根虫))和南美叶甲(Diabroticaspeciosa(葫芦甲虫))。dsRNA针对其可能有效的有害生物还包括农学家熟知的不同有害生物，例如线虫、金针虫和蛴螬，以及适当的土壤病原体，例如细菌和真菌。存在于或添加到细胞裂解物中的交联剂的浓度是相当显著的。如果裂解物中存在过多或过少的交联剂，或者过多或过少的交联剂添加到或以其他的方式出现在裂解物所添加的位置中，则能够表现出转录后基因沉默效应的dsRNA不是如此有效的。例如，在试剂是戊二醛并且发酵液包含大约40g/L生物质(作为离心球粒收集)的情况下，试剂在裂解物/在位置上以6％-0.1％的量存在，更优选地以2.5％至0.15％的量存在，并且仍然更有选地以0.7％至0.2％的量存在，其中该％是相对于裂解物的终体积。随着发酵液的浓度随着不同营养培养基和生长条件而变化，戊二醛的这些量将按比例调整。在该方法的一个特别优选的实施例中，裂解物是细菌细胞的裂解物，并且该试剂是戊二醛，其在裂解物中以裂解物的终体积的0.7％至0.2％的量存在。不受作用机制的任何具体解释的限制，过量的交联剂被理解为降低dsRNA的生物利用度，而太少的交联剂不赋予期望的稳定性改善。本专利技术方法的使用十分显著地延长了与存在于裂解物中的dsRNA相关的生物学活性的持续时间-与施用于土壤的裂解物中存在的但其中不使用交联剂的dsRNA相比，典型地在高于约12摄氏度的温度的土壤环境中在高达并超过14天的时段内保持活性，并且在甚至高达12周的时段内保持活性。本专利技术还包括包含细胞裂解物和蛋白质交联剂的物质的组合物，其特征在于该组合物包含土壤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基本上保留或以其他的方式保存存在于细胞裂解物中的dsRNA的生物活性,以转录后沉默在靶生物体中的基因表达的方法，该方法包括向该裂解物中添加具有蛋白质‑或胺‑交联剂功能的化合物的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.05 US 62/237,0551.一种基本上保留或以其他的方式保存存在于细胞裂解物中的dsRNA的生物活性,以转录后沉默在靶生物体中的基因表达的方法，该方法包括向该裂解物中添加具有蛋白质-或胺-交联剂功能的化合物的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中试剂在该裂解物形成时添加到细胞中，或在该裂解物形成后添加到该裂解物中。3.根据权利要求1所述的方法，其中试剂添加到该裂解物施用的位置。4.根据前述权利要求所述的方法，其中在施用该裂解物之前将试剂添加到该位置。5.根据权利要求3所述的方法，其中该位置是土壤。6.根据任何前述权利要求所述的方法，其中该交联剂选自下组，该组由以下组成：聚醛、二醛、二环氧化物、聚环氧化物、吡啶基二硫化物、多官能碳二亚胺、多官能马来酰亚胺、多官能亚氨酸酯、多官能n-羟基琥珀酰亚胺酯和多官能卤代缩醛。7.根据任何前述权利要求所述的方法，其中试剂是戊二醛。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中制备该裂解物的细胞是细菌细胞，任选地通过热失活在先失活。9.根据前述权利要求所述的方法，其中该细菌细胞已被工程化以包含DNA序列，该DNA序列在转录时产生双链RNA，其至少一部分包含与真核细胞中基因的mRNA的序列基本上相同的序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·菲尔德曼，J·D·福勒，W·玛德雷恩，I·马莱特，N·克罗姆赫科，
申请(专利权)人：先正达参股股份有限公司，德福根有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH