本实用新型专利技术公开了一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其包括荧光激发光路和荧光检测光路；沿荧光激发光路，光源装置发射的激发光依次经聚焦装置和物镜装置入射至置于载物台的数字PCR芯片上；沿荧光检测光路，数字PCR芯片受激发光产生的荧光依次经物镜装置、聚焦装置和成像装置成像后传输至图像采集传感器；其中，载物台还设有温控装置，温控装置实时控制数字PCR芯片反应的循环温度。本实用新型专利技术可以实现高通量、高灵敏度、高特异性的实时数字qPCR检测，对于提高数字PCR检测仪器性能、精度和通量具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置
本技术涉及生物医学检验领域核酸检测领域，特别涉及一种能够实现大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置。
技术介绍
在肿瘤早期诊断筛查、血液病毒分型及载量分析、无创产前诊断等领域，都需要对超低浓度的核酸进行高速高灵敏度高特异性的检测，常规的PCR已越来越无法满足需求。为实现此功能，人们在PCR基础上，发展了一种数字PCR技术，将检测灵敏度提高了1～2个数量级。微滴式数字PCR采用的“分而治之”(divideandconquer)的检测策略，将样品、PCR试剂混合物作为分散相，将油作为连续相，利用微流控技术，将样品混合物形成一个个液滴悬浮于连续相中。进而，将一个标准PCR扩增分配至大量微滴(纳升至皮升)中，每个微滴中仅包含0个或1个拷贝的目标分子(DNA模板)。对每个微滴进行独立PCR扩增，扩增结束后，检测每个微滴的荧光，对阳性信号的微滴进行计数，从而得到样品模板的绝对拷贝数和核酸浓度。微滴的尺寸和数量决定了数字PCR的检测灵敏度和下限，现有的数字PCR微滴数在2万～1000万之间。现有的商用微滴式数字PCR技术操作如下：在专用的微滴制备芯片上制备液滴；通过移液器将微滴转移至离心管中，使用常规的PCR仪进行温度循环扩增；扩增完成后，利用流式技术依次对每个微滴进行荧光激发与探测，计算结果。这样的检测方式存在以下问题：(1)流式检测速度较慢，检测速度在200～500个/s，检测过程耗时久，通量低；(2)只能对单个微滴进行终点法检测,不能实时qPCR，降低了特异性和灵敏度；(3)光路硬件复杂，难以实现多重数字PCR检测(4重以上)；(4)两次液滴的转移过程将导致微滴损失，以及可能引来的外界污染；(5)常规PCR扩增仪的加热块热惯量大，热循环时间长(2小时左右)。为解决上述五个问题，申请人已提出了一体式数字PCR芯片，并已申请技术专利(申请号201510961967.0)。参见附图1，一体式数字PCR芯片包括本体1，位于其上的连续相注入孔11、样品注入孔12、单层微滴平铺腔体15、真空接入孔16、用于生成微滴的“+字型”微结构13，以及用于连接连续相注入孔11和“+字型”微结构13的液路14、用于连接样品注入孔12和“+字型”微结构13的第一液路17、用于连接“+字型”微结构13和单层微滴平铺腔体15的第二液路18。通过MEMS工艺将所述所有微结构制作于一片聚合物基板上，随后与另一块聚合物平板相键合而形成封闭的微流道系统，在连续相注入孔11、样品注入孔12、真空接入孔16三处开孔，用于注入样品和施加负压。参照图2，其基本原理为：在连续相注入孔11注入油、样品注入孔12注入样品后，在真空接入孔16施加真空负压，样品、连续相将在负压的作用下，通过流道14和17到达“+字型”微结构13。在此处，样品将因连续相的剪切而形成一个个纳升级微滴20，随后经过流道18进入单层微滴平铺腔体15，平铺成微滴单层19。该技术方法具有以下优势：微滴单层19适用于使用CCD进行图像化荧光拍照检测，具有较高的通量和速度；通过连续荧光图像检测可以获得微滴荧光随循环此时的变化曲线，进行单液滴qPCR检测，具有较高灵敏度和特异性；通过增加激发光源和滤光片，可轻易实现多重数字PCR；整个过程一体化完成，不存在微滴损失和外界的污染。最后，单层微滴将具有较大的温控面积和较小的热惯量，可以将PCR循环扩增时间降低至半小时以内。为了利用该数字PCR芯片进行核酸检测，一方面需要对该数字PCR微流控芯片进行温度循环扩增，另一方面需要对数字PCR液滴单层进行实时激光激发和荧光成像探测。每温度循环一次，便进行一次液滴荧光图像检测，以获得每个液滴的荧光连续变化曲线。为提高通量，在一块芯片上，可集成多个一体式数字PCR微流控结构，形成32个、48个甚至96个样品的同时检测(参照图3)，以便提高通量，这样便需要芯片可以进行一维或二维的运动，以便可以通过扫描方式进行大面积图像采集。另外，为提高检测效率，采用一种新算法，先通过小倍率进行粗略大视场观看，发现可能存在液滴荧光点后，切换成高倍率精细小视场观测的方式，以提高效率。但现有的检测装置如荧光显微镜等，无法满足上述检测要求。
技术实现思路
本技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本技术还有一个目的是提供一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其通过系统光路的设计以及分割检测区域的连续扫描，能够实现数字PCR的高通量、实时和精准定量检测，此外，通过大小扫面视场的切换可实现液滴荧光点的快速定位和检测。为了实现根据本技术的这些目的和其它优点，提供了一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，包括荧光激发光路和荧光检测光路；沿所述荧光激发光路，光源装置发射的激发光依次经聚焦装置和物镜装置入射至置于载物台的数字PCR芯片上；沿所述荧光检测光路，所述数字PCR芯片受所述激发光产生的荧光依次经所述物镜装置、所述聚焦装置和成像装置成像后传输至图像采集传感器；其中，其中所述载物台还设有温控装置，所述温控装置实时控制所述数字PCR芯片反应的循环温度。优选的是，其中，所述载物台固定设于光路路径上，或至少具有一个平移自由度，以满足大面积图像采集的需要。优选的是，其中，所述物镜装置包括：一个物镜，其固定设于光路中；或若干个不同倍率的物镜，其以可切换的形式分别被配置至光路中，从而实现不同倍率的数字PCR微滴荧光成像。优选的是，其中，所述物镜的倍率选自2X、4X、5X或10X。优选的是，其中，所述光源装置包括：光源组件，其提供平行混合光源；光源滤光片组件，其具有：一个光源滤光片，其固定设于所述荧光激发光路中，或若干个光源滤光片，其以可切换的形式分别被配置至所述荧光激发光路中。光源滤光片可用于对混合光源进行滤光处理，以提供可用于激发PCR微滴染料所需的单色光源。本方案中采用混合光源和滤光片来产生单色光源，可以以较低的成本提供多个波长的单色激发光源，实现多重数字PCR功能。优选的是，其中，所述光源装置包括若干个单色光源组；沿光路前进方向，所述单色光源组依次包括：单色光源、快门和光源透镜；其中，所述快门通断控制所述荧光激发光路。优选的是，其中，所述光源装置包括：至少两个单色光源组，以提供较强的激发光源；；若干个第一分色镜，其将所述单色光源组的发射光路合束并导入所述荧光激发光路。分色镜可用于将两路激发光源合并成一束，利用多个二色镜可以将所有的激发光源合并成一束，从而提供多个不同波长的激发光源，实现多重数字PCR功能。优选的是，其中，聚焦装置包括：第二分色镜，其反射光源装置发射的激发光同时透过所述数字PCR芯片受激产生的荧光。优选的是，其中，聚焦装置还包括：第一聚焦透镜组件，其设于所述光源装置与所述第二分色镜之间，用于整形和扩束所述激光，从而获得较好的激发光。优选的是，其中，聚焦装置还包括：第二聚焦透镜组件，其设于所述第二分色镜与所述成像装置之间，用于整形和扩束所述荧光，从而获得较好的成像质量。优选的是，其中，沿所述荧光检测光路，所述成像装置依次包括荧光滤除组件和荧光成像透镜；优选的是，沿所述荧光检测光路，所述成像装置依次包括单个荧光滤光组件和荧光成本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，包括荧光激发光路和荧光检测光路；沿所述荧光激发光路，光源装置发射的激发光依次经聚焦装置和物镜装置入射至置于载物台的数字PCR芯片上；沿所述荧光检测光路，所述数字PCR芯片受所述激发光产生的荧光依次经所述物镜装置、所述聚焦装置和成像装置成像后传输至图像采集传感器；其中，其中所述载物台还设有温控装置，所述温控装置实时控制所述数字PCR芯片反应的循环温度。
【技术特征摘要】
1.一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，包括荧光激发光路和荧光检测光路；沿所述荧光激发光路，光源装置发射的激发光依次经聚焦装置和物镜装置入射至置于载物台的数字PCR芯片上；沿所述荧光检测光路，所述数字PCR芯片受所述激发光产生的荧光依次经所述物镜装置、所述聚焦装置和成像装置成像后传输至图像采集传感器；其中，其中所述载物台还设有温控装置，所述温控装置实时控制所述数字PCR芯片反应的循环温度。2.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述载物台固定设于光路路径上，或至少具有一个平移自由度。3.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述物镜装置包括：一个物镜，其固定设于光路中；或若干个不同倍率的物镜，其以可切换的形式分别被配置至光路中。4.如权利要求3所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述物镜的倍率选自2X、4X、5X或10X。5.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述光源装置包括：光源组件，其提供平行混合光源；光源滤光片组件，其具有：一个光源滤光片，其固定设于所述荧光激发光路中，或若干个光源滤光片，其以可切换的形式分别被配置至所述荧光激发光路中。6.如权利要求1所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其特征在于，所述光源装置包括若干个单色光源组；沿光路前进方向，所述单色光源组依次包括：单色光源、快门和光源透镜；其中，所述快门通断控制所述荧光激发光路。7.如权利要求6所述的大面积数字PCR微滴荧光高通量检...
【专利技术属性】
技术研发人员：周武平，黎海文，蒋克明，刘聪，张涛，刘聪，印晨宇，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：新型
国别省市：江苏,32
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