一种双功能酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用技术

本发明专利技术公开了一种双功能酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用。本发明专利技术通过用不同长度及不同刚柔性的连接肽融合表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶，率先将MTSase与MTHase进行融合表达，得到一系列同时具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的双功能酶，并将其用于海藻糖的生产，进一步提高了海藻糖的转化率，并减少了培养菌株的数量，节约了生产工艺与成本，为海藻糖的经济高效生产奠定了基础。

Preparation of a bifunctional enzyme and its application in trehalose production

The invention discloses a preparation method of a bifunctional enzyme and its application in trehalose production. By fusion expression of maltooligosaccharide trehalose synthetase and maltose oligosaccharide hydrolysase with different lengths and different rigid flexible connective peptides, the MTSase and MTHase were fused and expressed, and a series of double malt oligosaccharide synthetases and maltose oligosaccharide glycosyl glycosyl hydrolyase activities were obtained. The function enzyme is used in the production of trehalose, which can further improve the conversion rate of trehalose, reduce the number of culture strains, save the production process and cost, and lay the foundation for the economic and efficient production of trehalose.

【技术实现步骤摘要】
一种双功能酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种双功能酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用。
技术介绍
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α-1,1糖苷键结合的非还原性糖，分子式为C12H22011，其相对分子量为342.30。其结构式如式1所示：海藻糖广泛存在于细菌、酵母、藻类、真菌、昆虫以及一些抗逆性植物中。它对生物大分子具有非特异性的保护作用，这种保护作用体现在：当生物细胞处于饥饿、干燥、高温、高渗透压等恶劣环境时，细胞内海藻糖含量迅速上升，对多种大分子产生保护作用，从而维持生物体生命特性，因此海藻糖在科学界素有“生命之糖”的美誉。目前海藻糖的生产工艺主要有如下三种：一是微生物提取法，二是微生物发酵法，三是酶转化法。酶转化法因为底物来源广泛，转化率高，是工业化生产海藻糖的主要方法。酶转化法根据底物的不同又可以分为如下三种方法：(1)以葡萄糖为底物：利用专一性很强的海藻糖-6-磷酸合成酶与海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶共同作用生成海藻糖，该方法以葡萄糖-6-磷酸为糖基受体，以UDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖为糖基供体，在整个反应中要消耗高能物质，因此难以实现工业化生产。(2)以麦芽糖为底物的单酶法：海藻糖合成酶具有较严格的底物专一性，只作用于麦芽糖生成海藻糖及海藻糖生成麦芽糖。此方法反应简单，底物麦芽糖价格便宜，这是较理想的工业生产途径。但海藻糖合成酶催化的是一个可逆反应，它既可以催化麦芽糖生成海藻糖，也可以催化海藻糖生成麦芽糖，当反应进行到一定程度时麦芽糖与海藻糖的转化会达到相对平衡，因此转化率达到60％-70％以后难以再有提高。(3)以淀粉为底物的双酶法：利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻海藻糖水解酶的作用将淀粉水解物转化为海藻糖，这类酶体系转化率可达80％以上，1995年日本林原公司将该方法应用于工业化大规模生产海藻糖，使海藻糖的价格大大降低。利用双酶法转化率高，原料淀粉价格便宜，来源广泛，是海藻糖工业化生产的主要方法。以上方法中，以淀粉为底物双酶生产海藻糖是一种较为经济的方式，但目前生产方式存在酶的产量低，转化率得不到进一步提高等问题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种融合蛋白。本专利技术提供的融合蛋白由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶和用于连接二者的连接肽组成；所述连接肽氨基酸序列为序列4或序列8。上述融合蛋白中，所述连接肽的个数为1个或2个或3个或4个或5个或6个。上述融合蛋白中，所述融合蛋白的氨基酸序列由所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶氨基酸序列、所述连接肽氨基酸序列和所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列组成；且所述连接肽氨基酸序列的第一个氨基酸残基与所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶氨基酸序列的最后一个氨基酸残基紧邻，所述连接肽氨基酸序列的最后一个氨基酸残基与所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列的第一个氨基酸残基紧邻。上述融合蛋白中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶氨基酸序列为序列2的第1-775位；所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列为序列2的第776-1373位。本专利技术的第二个目的是提供与上述融合蛋白相关的生物材料。本专利技术提供的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：A1)编码上述融合蛋白的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述生物材料中，所述核酸分子为如下1)-3)所示的基因：1)其核苷酸序列由所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码DNA分子核苷酸序列、所述连接肽编码DNA分子核苷酸和所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶编码DNA分子核苷酸组成；且所述连接肽编码DNA分子核苷酸的第一个碱基与所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码DNA分子核苷酸的最后一个碱基紧邻，所述连接肽编码DNA分子核苷酸的最后一个碱基与所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶核苷酸序列的第一个碱基紧邻；所述连接肽编码DNA分子核苷酸为序列3或序列7；所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶编码DNA分子核苷酸序列为序列1第426-2750位；所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶编码DNA分子核苷酸序列为序列1第2751-4547位；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述融合蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述融合蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。本专利技术的第三个目的是提供上述融合蛋白的新用途。本专利技术提供了上述融合蛋白在作为双功能酶中的应用。本专利技术的第四个目的是提供上述生物材料的新用途。本专利技术提供了上述生物材料在制备双功能酶中的应用。上述应用中，所述双功能酶为同时具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的双功能酶。本专利技术的第五个目的是提供上述融合蛋白或上述生物材料的新用途。本专利技术提供了上述融合蛋白或上述生物材料在如下b1)-b6)中任一种中的应用：b1)海藻糖生产；b2)制备海藻糖生产的产品；b3)提高海藻糖生产的效率；b4)制备提高海藻糖生产的效率的产品。b5)提高海藻糖转化率；b6)制备提高海藻糖转化率的产品。本专利技术的第六个目的是提供上述融合蛋白的制备方法。本专利技术提供的上述融合蛋白的制备方法包括如下步骤：将上述融合蛋白的编码基因导入宿主菌中，得到重组菌；诱导培养所述重组菌，得到所述融合蛋白。上述方法中，所述宿主菌为大肠杆菌BW25113。本专利技术的第七个目的是提供一种海藻糖的生产方法。本专利技术提供的海藻糖的生产方法包括如下步骤：利用上述融合蛋白将淀粉水解物或淀粉转化为海藻糖。上述方法中，所述融合蛋白和所述淀粉水解物的质量比为0.25mg：1g。本专利技术的技术方案与现有技术方案相比具有如下优点：(1)本专利技术率先将MTSase与MTHase进行融合表达，得到一系列同时具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的双功能酶，并将其用于海藻糖的生产。双功能酶的使用使原来需要培养的两株菌减少为一株，简化菌体培养的成本。(2)MTHase单独表达时容易形成包涵体，其与MTSase融合表达后形成的融合酶绝大部分都以可溶形式存在，融合后提高了MTHase的可溶性。将上述融合酶用于海藻糖的生产，与自由酶相比，融合酶的使用提高了海藻糖生产的效率，并同时也提高了海藻糖的转化率。(3)相关文献(Seo,J.S.,etal."BifunctionalrecombinantfusionenzymebetweenmaltooligosyltrehalosesynthaseandmaltooligosyltrehalosetrehalohydrolaseofthermophilicmicroorganismMetallosphaerahakonensis."JournalofMicro本文档来自技高网...

【技术保护点】
融合蛋白，其由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶和用于连接二者的连接肽组成；所述连接肽氨基酸序列为序列4或序列8。

【技术特征摘要】
1.融合蛋白，其由麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶和用于连接二者的连接肽组成；所述连接肽氨基酸序列为序列4或序列8。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述连接肽的个数为1个或2个或3个或4个或5个或6个。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列由所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶氨基酸序列、所述连接肽氨基酸序列和所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列组成；且所述连接肽氨基酸序列的第一个氨基酸残基与所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶氨基酸序列的最后一个氨基酸残基紧邻，所述连接肽氨基酸序列的最后一个氨基酸残基与所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列的第一个氨基酸残基紧邻。4.根据权利要求1-3中任一所述的融合蛋白，其特征在于：所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶氨基酸序列为序列2的第1-775位；所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列为序列2的第776-1373位。5.与权利要求1-4任一所述的融合蛋白相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：A1)编码权利要求1-4任一所述的融合蛋白的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。6.根据权利要求5所述的相关生物材料，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-3)所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林白雪，袁慎键，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11