一种肺癌耐药细胞系及其制备方法技术

本发明专利技术涉及耐药细胞系领域，特别涉及一种肺癌耐药细胞系及其制备方法。一种肺癌耐药细胞系的制备方法：肺癌细胞接种于含有21‑93nM肺癌靶向药的培养基中培养，至细胞在该浓度下正常存活和增殖；以50nM的浓度差提升进行培养；至细胞增殖抑制浓度达到IC50的4倍时，按每100nM的浓度差提升进行培养；药物筛选浓度达到IC50的8倍时，按每1μM的浓度差提升培养，直至肺癌细胞能够在10μM奥希替尼的细胞培养体系中维持存活和增殖时，得到肺癌耐药细胞系。该方法在逐步提高培养基中药物浓度的基础上制得耐药细胞系，为后期模拟临床药物耐药，研究肺癌靶向药物耐药机制，研发有效的抗癌药物提供基础。

A lung cancer resistant cell line and its preparation method

The invention relates to the field of drug-resistant cell lines, in particular to a lung cancer drug-resistant cell line and a preparation method thereof. A method of preparation of lung cancer resistant cell lines: lung cancer cells were inoculated in a medium containing 21 93nM lung cancer targeted drugs to survive and proliferate at this concentration, and cultured with the concentration difference of 50nM; when the cell proliferation inhibition concentration reached 4 times that of IC50, the culture was promoted according to the concentration difference of each 100nM. When the drug screening concentration reached 8 times of IC50, the lung cancer cell line was obtained when the lung cancer cells were able to survive and proliferate in the 10 uitinib cell culture system of 10 micron M. In this method, drug resistant cell lines are prepared on the basis of increasing the drug concentration in the medium. It provides a basis for the late simulation of drug resistance in clinical drugs, to study the drug resistance mechanism of lung cancer targeting drugs and to develop effective anticancer drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种肺癌耐药细胞系及其制备方法
本专利技术涉及耐药细胞系领域，具体而言，涉及一种肺癌耐药细胞系及其制备方法。
技术介绍
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，可分为小细胞肺癌和非小型细胞肺癌，其中非小型细胞肺癌约占全部肺癌的80％。据2017年国家癌症中心发布，肺癌已成为中国发病率和死亡率最高的癌症，且大多数患者确诊时已经为晚期。晚期肺癌的治疗多是通过化疗手段，但是由于肿瘤细胞的异质性、多变性等特点，导致许多肿瘤患者对化疗药物不敏感，或者在化疗过程中逐渐对药物产生耐受性，从而导致肿瘤的复发或患者的死亡。肺癌肿瘤的耐药发生主要是因为表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)突变，针对EGFR的突变，临床上主要是应用酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)来治疗，但是一段治疗之后又会发生新的耐药，因此，针对耐药后肺癌的治疗显得尤为重要。奥希替尼(osimertinib，AZD9291)是继EGFR-TKI耐药后疗效显著的第三代靶向药物，可同时对付非小细胞肺癌的EGFR基因突变(包括18，19，21号外显子突变)和EGFR-TKI获得性耐药(T790M)，为晚期肺癌患者延长了生命，但是，不可避免的是一段时间后肺癌患者仍会发生耐药。目前针对肺癌的EGFR-TKI耐药研究主要涉及到PI3K/Akt/mTOR、Ras/Erk及Jak-STAT3等信号通路，但随着耐药的发生，研究有效的药物靶点就显得尤为重要。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种肺癌耐药细胞系的制备方法，以肺癌H1975、HCC827细胞为对象，将AZD9291以逐步增加药物浓度法建立耐药细胞系，试验步骤简便易行，便于产业化制备。本专利技术的第二目的在于提供上述制备方法制得的肺癌耐药细胞系，该耐药细胞系为后期模拟临床药物耐药，研究肺癌靶向药物耐药机制，研发有效的抗癌药物提供基础。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种肺癌耐药细胞系的制备方法，包括以下步骤：(a)、对数生长期的肺癌细胞接种于含有21-93nM肺癌靶向药的培养基中培养，细胞恢复至正常生长时，再次加入相同浓度的药物，直至细胞在该浓度下正常存活和增殖，以此作为一个培养循环；(b)、以50nM的浓度差提升进行培养，处理20-28h后，更换无药物浓度的培养基培养24h-72h，以此为一个循环，直至在相应药物浓度下细胞正常生长；(c)、至细胞增殖抑制浓度达到IC50的4倍时，按每100nM的浓度差提升进行培养，处理时间20-28h，观察细胞状态：若细胞状态好，则以含当前浓度药物的培养基筛选1周，随后继续增加药物浓度；若细胞状态不好，则更换无药物培养基培养24h-48h，随后继续加入药物，如此反复直至细胞在此药物浓度下正常生长；(d)、至药物筛选浓度达到IC50所用药物浓度的8倍时，按每1μM的浓度差提升培养，处理时间20-28h，观察细胞状态：如果细胞状态不好，则更换无药物培养基培养24h-48h，随后继续加入药物，如此反复直至细胞在此药物浓度下正常生长；如果细胞状态好，则以含当前浓度药物的培养基筛选1周，随后继续增加药物浓度，直至肺癌细胞能够在10μM奥希替尼的细胞培养体系中维持存活和增殖时，得到所述肺癌耐药细胞系。本专利技术提供的一种肺癌耐药细胞系的制备方法，经大量实验摸索意外发现，在逐步提高培养基中药物浓度的基础上即可制得肺癌耐药细胞系，试验步骤简便易行，便于产业化制备，制得的该耐药细胞系为后期模拟临床药物耐药，研究肺癌靶向药物耐药机制，研发有效的抗癌药物提供基础。本专利技术中，IC20表示20％抑制浓度，IC50表示半抑制浓度。进一步地，所述培养基为含10％±1％胎牛血清的RPMI1640培养液。进一步地，所述培养为：37℃、5％CO2孵育箱中培养。进一步地，步骤(a)中，所述接种按0.8×106-2×106个细胞/ml接种于培养基内。进一步地，所述肺癌细胞为H1975细胞或HCC827细胞。进一步地，所述肺癌靶向药为奥希替尼。进一步地，所述耐药细胞冻存后复苏，细胞在IC20的药物维持浓度中稳定存活和繁殖。本专利技术还提供了上述的制备方法制得的肺癌耐药细胞系。经试验测定，所述肺癌耐药细胞系相比于该细胞系正常细胞，细胞变大，形状为梭形。测定细胞增殖发现，所述肺癌耐药细胞系相比于该细胞系正常细胞，增殖速度变慢。测定细胞侵袭能力发现，细胞侵袭能力增强。测定耐药性，所述肺癌耐药细胞系相比于该细胞系正常细胞，药物耐受性增加。计算出的IR值分别为：H1975IR＝36.73，HCC827IR＝74.62。均证实耐药细胞良好的药物耐受性。进一步地，所述肺癌耐药细胞系相比于该细胞系正常细胞，还具有以下特征：增殖速度变慢，细胞侵袭能力增强，药物耐受性增加。综上可知，本专利技术对肺癌细胞H1975和HCC827采用逐步增加药物浓度法可获得对应的奥希替尼(AZD9291)肺癌耐药细胞株H1975/RS和HCC827/RS。通过细胞功能学实验，我们能够看到肺癌耐药细胞株H1975/RS和HCC827/RS形态上体积增大，其中H1975/RS呈现出明显的梭形，且H1975/RS和HCC827/RS相较于H1975和HCC827增殖周期变长、侵袭能力增强且药物耐受性大大增加，比如H1975/RS的耐药指数为36.73，而HCC827的耐药指数高达74.62。成功获得肺癌H1975和HCC827的耐药细胞株H1975/RS和HCC827/RS。本专利技术人经过多次试验，均能制备得到肺癌耐药细胞系，因此，所属
的技术人员可以重复本专利技术提供的技术方案，并能够解决申请所要解决的技术问题，达到该技术方案的效果。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供的肺癌耐药细胞系的制备方法，意外发现，通过初期药物浓度以小幅度增加逐步提高，后期加大药物浓度幅度，能有效诱导耐药细胞的形成。(2)本专利技术提供的肺癌耐药细胞系的制备方法，诱导时间为6个月，制备可行，并且试验步骤简便易行，便于产业化制备。(3)本专利技术制备的肺癌耐药细胞系，形态上体积增大，呈现出明显的梭形，增殖周期变长、侵袭能力增强且药物耐受性大大增加。(4)本专利技术提供的肺癌耐药细胞系，为后期模拟临床药物耐药，研究肺癌靶向药物耐药机制，研发有效的抗癌药物提供基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本专利技术实施例中细胞耐药前后形态图；图2为本专利技术实施例中细胞耐药前后细胞增殖曲线图；图3为本专利技术实施例中细胞耐药前后细胞测定的IC50曲线图；图4为本专利技术实施例中细胞耐药前后细胞侵袭能力显微镜图；图5为本专利技术实施例中细胞耐药前后细胞侵袭能力曲线图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1复苏肺癌细胞系H1975细胞后，使用含10％胎牛血清的RPMI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺癌耐药细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)、对数生长期的肺癌细胞接种于含有21‑93nM肺癌靶向药的培养基中培养，细胞恢复至正常生长时，再次加入相同浓度的药物，直至细胞在该浓度下正常存活和增殖，以此作为一个培养循环；(b)、以50nM的浓度差提升进行培养，处理20‑28h后，更换无药物浓度的培养基培养24h‑72h，以此为一个循环，直至在相应药物浓度下细胞正常生长；(c)、至细胞增殖抑制浓度达到IC50的4倍时，按每100nM的浓度差提升进行培养，处理时间20‑28h，观察细胞状态：若细胞状态好，则以含当前浓度药物的培养基筛选1周，随后继续增加药物浓度；若细胞状态不好，则更换无药物培养基培养24h‑48h，随后继续加入药物，如此反复直至细胞在此药物浓度下正常生长；(d)、至药物筛选浓度达到IC50所用药物浓度的8倍时，按每1μM的浓度差提升培养，处理时间20‑28h，观察细胞状态：如果细胞状态不好，则更换无药物培养基培养24h‑48h，随后继续加入药物，如此反复直至细胞在此药物浓度下正常生长；如果细胞状态好，则以含当前浓度药物的培养基筛选1周，随后继续增加药物浓度，直至细胞能够在10μM的奥希替尼的培养体系中维持存活和增殖时，得到所述肺癌耐药细胞系。...

【技术特征摘要】
1.一种肺癌耐药细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)、对数生长期的肺癌细胞接种于含有21-93nM肺癌靶向药的培养基中培养，细胞恢复至正常生长时，再次加入相同浓度的药物，直至细胞在该浓度下正常存活和增殖，以此作为一个培养循环；(b)、以50nM的浓度差提升进行培养，处理20-28h后，更换无药物浓度的培养基培养24h-72h，以此为一个循环，直至在相应药物浓度下细胞正常生长；(c)、至细胞增殖抑制浓度达到IC50的4倍时，按每100nM的浓度差提升进行培养，处理时间20-28h，观察细胞状态：若细胞状态好，则以含当前浓度药物的培养基筛选1周，随后继续增加药物浓度；若细胞状态不好，则更换无药物培养基培养24h-48h，随后继续加入药物，如此反复直至细胞在此药物浓度下正常生长；(d)、至药物筛选浓度达到IC50所用药物浓度的8倍时，按每1μM的浓度差提升培养，处理时间20-28h，观察细胞状态：如果细胞状态不好，则更换无药物培养基培养24h-48h，随后继续加入药物，如此反复直至细胞在此药物浓度下正常生长；如果细胞状态好，则以含当前浓度药物的培养基筛选1周，随后继续增加药物浓度，直至细胞能够在10μM的奥希替尼的培养体系中维持存活和增殖时，得到所述肺癌耐药细...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨运海，陈天翔，
申请(专利权)人：上海市胸科医院，
类型：发明
国别省市：上海,31