一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料技术

本发明专利技术公开了一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料。该方法包括：1)提供DNA分子，该DNA分子表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白；2)将该DNA分子导入生物细胞，得到含有所述DNA分子的重组生物细胞，用培养基培养该重组生物细胞，使所述融合蛋白表达，用结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠从培养基中收集融合蛋白，得到融合蛋白‑免疫磁珠复合物；3)将该融合蛋白‑免疫磁珠复合物在含有所述分泌型报告蛋白的底物的液体中检测所述分泌型报告蛋白的信号，根据所述信号确定所述分泌型报告蛋白的含量。本发明专利技术降低了检测的噪声背景并增加了灵敏性和准确性；增强了检测的应用性和重复性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料
本专利技术涉及生物领域中一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料。
技术介绍
生物发光成像是目前在基础生物医学研究中非常受重视且广泛应用的一种技术。在体内或体外实验中，生物发光是化学能转化为可见光。该反应基于荧光素酶在氧的存在下，使荧光素底物发生生化转化，产生发射光。在过去的十年中，生物发光成像已成为非侵入性监测的生物学方法，例如用于基因表达、蛋白质-蛋白质相互作用、T细胞和干细胞转运、肿瘤发生和治疗应答等方面，并进一步用于药物研发所需的高通量筛选实验的数据读出。分泌型Nanoluc(secNluc)(GenBank:AFI79293.1)是一个新设计的分泌荧光素酶，具有结构稳定，半衰期长的优点。其发光强度高，辉光型动力学表现优秀，因此将成为生物发光成像研究中最有价值的工具之一。这种工程化的荧光素酶是单体的，并且在活细胞内和培养基中，可以在几天的半衰期内保持较高的酶稳定性。它利用腔肠素或furimazine，一种腔肠素模拟为底物，产生辉光型发光。secNluc的发光信号更明亮，大约是已广泛应用于生物医学研究的萤火虫荧光素酶和海肾萤光素酶的150倍。这些优点使secNluc成为生物发光成像的一个吸引人的工具。目前secNluc已经被用来产生各种各样的转基因生物和细胞，用于体内和体外研究。与细胞内荧光素酶相比，分泌型荧光素酶在许多应用中是有特殊优点，例如非侵入性的定量评估、实时监测和药物高通量筛选。因此，分泌型的secNluc在这些研究领域中将成为有力的研究工具。尽管secNluc具有稳定性高，半衰期长和信号发射强度高的特点，但是报告系统应用该酶时有一些制约。例如，如同其它分泌型荧光素酶一样，secNluc分泌导致不可避免的与一些干扰成分的交融，如血清和残留的实验试剂、细胞培养时所用的培养基或在生物样品，如血液或尿液中存在；信号强度在低密度的细胞实验检测中可能不够强大。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何将分泌报告蛋白与周围的干扰因素分离开，降低检测中的信噪比，增加了检测的灵敏性和准确性，同时将分泌报告蛋白置于优化的反应体系，增强其辉光型动力学表现，并且实现对分泌报告蛋白的富集，增强了检测的灵敏度。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法。本专利技术所提供的检测分泌型报告蛋白含量的方法，包括：1)制备DNA分子，所述DNA分子表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白；2)将所述DNA分子导入生物细胞，得到含有所述DNA分子的重组生物细胞，用培养基培养所述重组生物细胞，使所述融合蛋白表达，用结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠从所述培养基中收集(富集)融合蛋白，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物；3)将所述融合蛋白-免疫磁珠复合物在含有所述分泌型报告蛋白的底物的液体中检测所述分泌型报告蛋白的信号，根据所述信号确定所述分泌型报告蛋白的含量。上述方法中，所述DNA分子可为载体或表达盒。所述DNA分子可只表达由所述分泌型报告蛋白和所述标签蛋白连接而成的融合蛋白，还可表达其它蛋白质，如当所述DNA分子为表达载体时，还可表达筛选标记蛋白。上述方法中，所述生物细胞可为离体的细胞。上述方法中，所述分泌型报告蛋白可为分泌型荧光素酶。上述方法中，所述分泌型荧光素酶可为如下P1)或P2)：P1)、氨基酸序列是序列表中序列2的第1-199位的蛋白质；P2)、氨基酸序列与序列表中序列2的第1-199位具有90％以上的同一性且具有分泌型荧光素酶活性的蛋白质。上述方法中，具有90％以上的同一性可为具有至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。上述方法中，所述标签蛋白(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白。Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽，其氨基酸序列为DYKDDDDK。上述方法中，所述融合蛋白的氨基酸序列可为序列表中序列2。上述方法中，所述液体由溶质和溶剂组成，所述溶质为所述分泌型报告蛋白的底物，所述溶剂为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为TritonX-100，所述溶剂为磷酸盐缓冲液(PBS)。上述方法中，所述PBST缓冲液的pH值为7.0-8.5，如7.5，TritonX-100在所述PBST缓冲液的体积百分浓度为0.01％-0.1％。上述方法中，所述磷酸盐缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为2mmol/L磷酸二氢钾，10mmol/L磷酸氢二钠，137mmol/L氯化钠，2.7mmol/L氯化钾；所述溶剂为水。为了解决以上技术问题，本专利技术还提供了检测分泌型报告蛋白含量的成套系统(试剂盒或成套试剂)本专利技术所提供的检测分泌型报告蛋白含量的成套系统，包括a、b和c；所述a为所述DNA分子，所述b为所述分泌型报告蛋白的底物，所述c为所述结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠。上述检测分泌型报告蛋白含量的成套系统还可包括所述PBST缓冲液。上述检测分泌型报告蛋白含量的成套系统可只由所述a、所述b、所述c和所述PBST缓冲液组成。所述融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料也属于本专利技术的保护范围，所述生物材料可为下述B1)至B15)中的任一种：B1)编码所述融合蛋白的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述生物材料中，编码所述融合蛋白的核酸分子具体可为编码序列是序列表中序列1的第14-655位的DNA分子。上述生物材料中，B9)至B16)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。上述生物材料中，B9)至B12)所述的转基因动物细胞系可为将表达所述融合蛋白的DNA分子导入哺乳动物细胞系(如GP2-293细胞)得到的重组细胞。所述方法、所述成套系统、所述融合蛋白或所述生物材料的下述1)-7)中的任一种应用也属于本专利技术的保护范围：1)在检测基因表达中的应用；2)在检测蛋白质-蛋白质相互作用中的应用；3)在检测T细胞转运中的应用；4)在检测干细胞转运中的应用；5)、在制备检测肿瘤发生的产品(试剂或试剂盒)中的应用；6)、在制备检测肿瘤治疗应答的产品(试剂或试剂盒)中的应用；7)、在制备筛选目标物(如药物)的产品(试剂或试剂盒)中的应用。本专利技术使分泌型荧光素酶(secNluc)融合标签蛋白构建出融合蛋白，从而将secNlu本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测分泌型报告蛋白含量的方法，包括：1)提供DNA分子，所述DNA分子表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白；2)将所述DNA分子导入生物细胞，得到含有所述DNA分子的重组生物细胞，用培养基培养所述重组生物细胞，使所述融合蛋白表达，用结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠从所述培养基中收集融合蛋白，得到融合蛋白‑免疫磁珠复合物；3)将所述融合蛋白‑免疫磁珠复合物在含有所述分泌型报告蛋白的底物的液体中检测所述分泌型报告蛋白的信号，根据所述信号确定所述分泌型报告蛋白的含量。

【技术特征摘要】
1.检测分泌型报告蛋白含量的方法，包括：1)提供DNA分子，所述DNA分子表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白；2)将所述DNA分子导入生物细胞，得到含有所述DNA分子的重组生物细胞，用培养基培养所述重组生物细胞，使所述融合蛋白表达，用结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠从所述培养基中收集融合蛋白，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物；3)将所述融合蛋白-免疫磁珠复合物在含有所述分泌型报告蛋白的底物的液体中检测所述分泌型报告蛋白的信号，根据所述信号确定所述分泌型报告蛋白的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分泌型报告蛋白为分泌型荧光素酶。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述分泌型荧光素酶为如下P1)或P2)：P1)、氨基酸序列是序列表中序列2的第1-199位的蛋白质；P2)、氨基酸序列与序列表中序列2的第1-199位具有90％以上的同一性且具有分泌型荧光素酶活性的蛋白质。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述标签蛋白为Flag标签蛋白。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述液体由溶质和溶剂组成，所述溶质为所述分泌型报告蛋白的底物，所述溶剂为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为TritonX-100，所述溶剂为磷酸盐缓冲液。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PBST缓冲液的pH值为7.0-8.5，TritonX-100在所述PBST缓冲液的体积百分浓度为0.01％-0.1％。7.检测分泌型报告蛋白含量的成套系统，包括a、b和c；所述a为权利要求1-4中任一所述的DNA分子，所述b为权利要求1-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长振，李晶哲，郭志兰，
申请(专利权)人：中国中医科学院医学实验中心，
类型：发明
国别省市：北京,11