一种基于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒制造技术

技术编号:18104968 阅读:96 留言:0更新日期:2018-06-03 04:14
本发明专利技术公开了一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒。所述试剂盒含有一组用于检测GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性PCR引物组合,包括一对甲基化引物和一对非甲基化引物,甲基化引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示,非甲基化引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示。本发明专利技术的基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒适于研究大量样本的DNA片段,具有方便快捷、灵敏度高、成本较低的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒
本专利技术涉及癌症早期筛查
,更具体地,涉及一种基于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒,
技术介绍
在生物个体的生长发育与繁殖过程中,维持遗传物质的稳定性是至关重要的。基因组表观遗传修饰就是其中一种重要的调节方式。主要包括DNA甲基化修饰与核小体中组蛋白的修饰等,使得被修饰DNA的空间结构发生改变或使染色体结构发生改变,导致基因的沉默或过度表达。这两种修饰都是在不改变DNA碱基种类与数量的前提下使生物体表型呈现出多样化。DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化在DNA复制起始、错配修复以及转座子的失活等过程中对维持遗传信息的稳定性发挥着重要的作用。DNA甲基化(DNAmethylation)是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)催化下,以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNMTs的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。哺乳动物基因组中,DNA甲基化多发生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。近年来的大量研究表明,DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。DNA甲基化在肿瘤中的作用主要表现在以下几个方面:一是甲基化的CpG岛二核苷酸中的胞嘧啶以较高的频率脱氨基变成胸腺嘧啶,造成基因突变;二是抑癌基因和DNA修复基因由于超甲基化而沉默;三是癌基因甲基化水平降低而活化;四是基因组总体甲基化水平降低使转座子、重复序列活化导致染色体稳定性下降。这些因素是导致肿瘤发展、转移、恶化最终导致患者死亡的重要原因。DNA总体甲基化水平(即甲基化谱)和特定基因甲基化程度改变可作为肿瘤诊断指标。但是并没有检测单个基因的DNA甲基化来进行癌症的早期筛查的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是为了克服现有技术的不足,提供一组用于检测GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性反应的PCR引物。本专利技术的第二个目的是提供一种所述的引物组合在制备基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒。为了实现上述目的,本专利技术是通过以下技术方案予以实现的:一组用于检测GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性PCR引物组合,包括一对甲基化引物和一对非甲基化引物,甲基化引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示,非甲基化引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3~4所示。所述的甲基化特异性PCR引物组合在制备基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒中的应用。一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒,含有所述的甲基化特异性PCR引物组合。优选地,还含有甲基化特异性PCR试剂、修饰基因组DNA试剂、脱盐脱磺酸基试剂、外周血白细胞DNA提取试剂和/或DNA纯化试剂。优选地,甲基化特异性PCR试剂包括:Taq酶,10×含Mg2+的PCR缓冲液,dNTPmixture,ddH2O。优选地,甲基化特异性PCR试剂的反应体系为:Taq酶0.1μl,10×含Mg2+的PCR缓冲液2μl,dNTPmixture1.6μl,上游引物1μl,下游引物1μl,待测样本DNA1μl,ddH2O13.3μl,总计反应体系20μl,其中上游引物和下游引物的浓度为10nM。优选地,甲基化引物的退火温度为64℃。优选地,甲基化引物的扩增反应程序为:预变性94℃5分钟,变性94℃30秒,退火64℃30秒,延伸72℃45秒,30个循环反应。优选地,非甲基化引物的退火温度为61℃。优选地,非甲基化引物的扩增反应程序为:预变性94℃5分钟,变性94℃30秒,退火61℃30秒,延伸72℃45秒,30个循环反应。优选地,修饰基因组DNA试剂含有:ddH2O,NaOH,NaHSO3,石蜡油,苯二酚(氢醌)。优选地,脱盐脱磺酸基试剂含有:Tris饱和酚,氯仿,异丙醇,乙醇,TE缓冲液。优选地,DNA纯化试剂为:蛋白酶K和RNA酶。甲基化特异性PCR的原理是基于DNA经亚硫酸氢钠处理后,所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。基于这种碱基的改变,然后设计针对甲基化和非甲基化序列的一对甲基化引物和一对非甲基化引物,并进行PCR扩增。其中,甲基化引物使用甲基化引物的扩增反应程序;非甲基化引物使用非甲基化引物的扩增反应程序。通过电泳检测甲基化特异性PCR的扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的甲基化引物能得到扩增片段,则说明该位点存在甲基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。与现有技术相比,本专利技术具有如下有益效果:本专利技术的基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒适于研究大量样本的DNA片段,具有方便快捷、灵敏度高、成本较低的优点。附图说明图1为本基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒和RT-PCR法检测健康人,肝细胞癌患者和非小细胞肺癌患者的结果。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本专利技术,并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例11、用于检测GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性反应的PCR引物设计:根据GRP78基因启动子序列如SEQIDNO:5所示,分析其CpG岛(CpGIsland),设计出5组引物(M,甲基化引物;U,未甲基化引物),如下表1:表12、引物筛选根据对引物GC含量(控制在45%-60%)、引物长度(控制在18-27bp,越短越好),以及检测效果等因素的考虑和实验结果,选择第1组引物为最佳引物。并进一步进行试验研究。实施例21、一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒,包括实施例1的用于检测GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性反应的PCR引物组合、甲基化特异性PCR试剂:HotstartTaq酶,10×含Mg2+的PCR缓冲液,dNTPmixture,ddH2O;修饰基因组DNA试剂:双蒸水,NaOH,NaHSO3,石蜡油,对苯二酚(氢醌);脱盐脱磺酸基试剂为:酚,氯仿,异丙醇,乙醇,TE缓冲液;DNA纯化试剂:蛋白酶K和RNA酶;DNA提取试剂为外周血白细胞DNA提取试剂盒。2、利用本专利技术的试剂盒检测人的外周全血标本的方法,包括如下步骤:1、模板DNA获取(1)外周血白细胞DNA提取和纯化外周血白细胞DNA提取和纯化采用本领域常规方法即可。本实施例提供一种选择:使用ThermoScientificGeneJET全血基因组DNA纯化试剂盒,具体过程如下:(i)取200μl人的外周全血(已加入乙二胺四乙酸(EDTA)、或枸橼酸钠、或肝素抗凝血)中加入20μl蛋白酶K溶液,涡旋混匀;加入20μlRNaseA溶液(10mg/ml)涡旋混匀;再加入400μl裂解液,涡旋混匀,得到均匀的悬液。(ii)将样本本文档来自技高网
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一种基于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒

【技术保护点】
一组用于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性PCR引物组合,其特征在于,包括一对甲基化引物和一对非甲基化引物,甲基化引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示,非甲基化引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性PCR引物组合,其特征在于,包括一对甲基化引物和一对非甲基化引物,甲基化引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示,非甲基化引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3~4所示。2.权利要求1所述的甲基化特异性PCR引物组合在制备基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒中的应用。3.一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒,其特征在于,含有权利要求1所述的甲基化特异性PCR引物组合。4.根据权利要求3所述的癌症早期筛查试剂盒,其特征在于,还含有甲基化特异性PCR试剂、修饰基因组DNA试剂、脱盐脱磺酸基试剂、外周血白细胞DNA提取试剂和/或DNA纯化试剂。5.根据权利要求4所述的癌症早期筛查试剂盒,其特征在于,甲基化特异性PCR试剂包括:Taq酶,10×含Mg2+的PCR缓冲液,dNTPmixture,ddH2O。6.根据权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员:朱萧罗辉
申请(专利权)人:广东医科大学
类型:发明
国别省市:广东,44

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