cfDNA捕获建库方法技术

本发明专利技术涉及一种cfDNA捕获建库方法，包括以下步骤：A.制作接头，对接头进行退火反应，纯化；B.对样本DNA进行处理，进行末端补齐反应；C.末端补齐的DNA片段进行加A反应；D.加A反应后的产物与接头进行连接反应；E.连接反应的产物采用探针组和单条引物对进行捕获延伸；F.捕获延伸后的产物采用上游引物和下游引物进行扩增得到文库。本发明专利技术的cfDNA捕获建库方法能够实现高灵敏度、快速、低成本的二代文库构建。

【技术实现步骤摘要】
cfDNA捕获建库方法
本专利技术涉及一种基于IonTorrent二代测序平台的DNA捕获建库方法，属于生物

技术介绍
新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的IonTorrentTM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究和医学检测。目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病，针对肿瘤病人的治疗首选靶向治疗。由于肿瘤发病机制复杂，肿瘤细胞存在异质性，因此，同种癌种适合的靶向药会有所不同。针对同种癌种不同治，同一个病人不同时期不同治的要求，在用药前对病人进行靶点的全面筛查成为必要。高通量测序技术使更全面更精准的筛选用药靶点成功实现。二代测序技术中的靶向测序同样具有巨大优势，由于测序的区域小，可以对某些区域进行深度测序，使得低频突变的检测率大大提高。肿瘤关键基因较多，适合使用二代测序对某些关键的基因进行深度测序，得到肿瘤致病突变信息及相关用药靶点信息。然而，传统靶点筛查需要取到病灶组织，这极大的限制了高通量测序技术在该领域的应用。开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断，成为新的需求，其中，最为突出的是对病人cfDNA进行检测是当前最具潜力的途径。由于cfDNA中所含来自肿瘤细胞的ctDNA往往使极微量的，因此，对检测灵敏度和准确度均提出了新的更高的要求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能够实现高灵敏度、快速、低成本的二代文库构建的cfDNA捕获建库方法。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种cfDNA捕获建库方法，包括以下步骤：A.制作接头，对接头进行退火反应，纯化；B.对样本DNA进行处理，进行末端补齐反应；C.末端补齐的DNA片段进行加A反应；D.加A反应后的产物与接头进行连接反应；E.连接反应的产物采用探针组和单条引物对进行捕获延伸；F.捕获延伸后的产物进行PCR扩增得到文库。上述接头是双链接头，由单链a和单链b组成，所述单链b包括从3’端至5’端依次设置的互补序列区域、任意碱基序列区域、样本barcode区域和Ion接头A部分的序列；所述互补序列区域中包括与单链a的序列反向互补的序列。上述单链a序列的碱基个数为13～16个；所述互补序列区域的碱基个数为17～20个；所述任意碱基序列区域是12个随机碱基；所述样本barcode区域的碱基个数为6个；所述Ion接头A部分的碱基个数为30～35个。上述单链a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述单链b的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。上述单链a的5’端设有磷酸化修饰；所述单链b的5’端的至少三个碱基上设有硫代磷修饰。上述步骤E中，所述探针组包括15个探针，分别是核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的探针a，核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的探针b，核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的探针c，核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的探针d，核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的探针e，核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的探针f，核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的探针g，核苷酸序列如SEQIDNo.10所示的探针h，核苷酸序列如SEQIDNo.11所示的探针i，核苷酸序列如SEQIDNo.12所示的探针j，核苷酸序列如SEQIDNo.13所示的探针k，核苷酸序列如SEQIDNo.14所示的探针l，核苷酸序列如SEQIDNo.15所示的探针m，核苷酸序列如SEQIDNo.16所示的探针n，核苷酸序列如SEQIDNo.17所示的探针o。上述步骤E中的反应体系中包括连接反应的产物19体积，探针组溶液2体积，单条引物溶液2体积，缓冲液3体积，dNTP溶液3体积，热启动酶0.3体积，纯水补足30体积；所述探针组中的各个探针在反应体系中的最终浓度均为1μM，所述单条引物在反应体系中的最终浓度为10μM。上述步骤E的反应条件是步骤一，在98℃，30min；步骤二，在98℃，20s，在65℃，15s，在72℃，30s，重复步骤二8次；步骤三，在72℃，5min；步骤四，保持在10℃。上述步骤E中，所述单条引物的核苷酸序列如SEQIDNo.18所示。上述步骤F中采用上游引物和下游引物进行PCR扩增，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.19所示，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.20所示；所述上下游引物在反应体系中的最终浓度均为10μM。本专利技术具有积极的效果：(1)本专利技术的cfDNA捕获建库方法关键步骤是连接反应的产物采用探针组和单条引物进行捕获延伸，一步完成，相较于现有的靶区域捕获方法，省去了杂交捕获的步骤，极大的节约了试剂成本；在捕获时避免了通用扩增，增加了靶区域产物量的比例，极大的缩短了建库时间；极大的减少了cfDNA的损失，保证了样本的丰富程度。本专利技术的cfDNA捕获建库方法基于IonTorrent二代测序平台，最低可以检测出样本DNA中0.01％的突变，满足了对cfDNA中极少量突变ctDNA检出的要求。(2)本专利技术的cfDNA捕获建库方法采用的分子接头是一种双链线形接头，接头的其中一条单链长度较长，包括12个随机碱基序列、样本barcode和Ion接头A部分，相对于普通接头，制作更为简单简洁，具有标记单个原分子的作用，能够识别不同样本的测序数据，较长的Ion接头A部分适于用特异性探针进行捕获延伸，提高了检测低频突变的灵敏度和准确度。(3)本专利技术的cfDNA捕获建库方法采用的分子接头包括磷酸化修饰和硫代磷修饰，5’端磷酸化有利于文库构建中与接头序列结合，硫代磷修饰有利于缓解环境中核酸外切酶的消化作用。附图说明图1是采用本专利技术实施例的建库方法通过IGV测序数据可视化软件得到的突变分析结果图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。主要试剂：所有试剂购买自正规厂家，文库构建试剂包括：VAhtstmNanoDNAlibraryprepKit(诺唯赞包括EndPrepMix、dA-TailingMix、LigationMix、AmplificationMix2，货号：602-02)、TakaraTaqHS试剂(大连宝生物，货号：AC1401A)、AmPureXPReagent磁珠(Beckman)等。上机模板准备和上机过程中用到的试剂和耗材与IonTorrent二代测序平台相配套，包括PGMTemplateOT2kit和Ion316chip等部分。本方法实验前需要新鲜配制的试剂：75％乙醇(100％乙醇与无核酸酶水按3:1比例配制)。主要仪器：PCR仪(厂家：EXce本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种cfDNA捕获建库方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，包括以下步骤：A．制作接头，对接头进行退火反应，纯化；B．对样本DNA进行处理，进行末端补齐反应；C．末端补齐的DNA片段进行加A反应；D．加A反应后的产物与接头进行连接反应；E．连接反应的产物采用探针组和单条引物对进行捕获延伸；F．捕获延伸后的产物进行PCR扩增得到文库。

【技术特征摘要】
1.一种cfDNA捕获建库方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，包括以下步骤：A．制作接头，对接头进行退火反应，纯化；B．对样本DNA进行处理，进行末端补齐反应；C．末端补齐的DNA片段进行加A反应；D．加A反应后的产物与接头进行连接反应；E．连接反应的产物采用探针组和单条引物对进行捕获延伸；F．捕获延伸后的产物进行PCR扩增得到文库。2.根据权利要求1所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述接头是双链线形接头，由单链a和单链b组成，所述单链b包括从3’端至5’端依次设置的互补序列区域、任意碱基序列区域、样本barcode区域和Ion接头A部分的序列；所述互补序列区域中包括与单链a的序列反向互补的序列。3.根据权利要求2所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述单链a序列的碱基个数为13～16个；所述互补序列区域的碱基个数为17～20个；所述任意碱基序列区域是12个随机碱基；所述样本barcode区域的碱基个数为6个；所述Ion接头A部分的碱基个数为30～35个。4.根据权利要求3所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述单链a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述单链b的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。5.根据权利要求4所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述单链a的5’端设有磷酸化修饰；所述单链b的5’端的至少三个碱基上设有硫代磷修饰。6.根据权利要求4所述的cfDNA捕获建库方法，其特征在于：所述步骤E中，所述探针组包括15个探针，分别是核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的探针a，核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的探针b，核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的探针c，核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新泰，王明，潘文健，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31