恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针制造技术

本发明专利技术公开了恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针，所述RPA专用引物的正向引物序列为CCCAGGAGACCAGCAGACTGTTGAACCCGTAC，反向引物序列为GTATCCGCCTCGTCCATCATAGAGCCGAAACC；探针序列为cactctggcgacgcgtttgtggttgaaccgcca(BHQ1‑dt)c(THF)g(FAM‑dT)ggaggcttcaaaggc(C3spacer)，在第34个bp位置有一个(BHQ1‑dt)基团，在第36bp位置有一个(THF)基团，在38bp位置有一个(FAM‑dT)基团，尾部含有一个(C3spacer)修饰。采用包括上述引物和探针的RPA试剂盒可以快速且成功检测鲤疱疹病毒CyHV‑II。

【技术实现步骤摘要】
恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针
本专利技术属于生物
，涉及II型鲤疱疹病毒的检测技术，具体涉及恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针，及在检测II型鲤疱疹病毒的应用。
技术介绍
疱疹病毒性造血器官坏死病(herpesviralhaematopoieticnecrosis，HVHN)是金(鲫)鱼的一种高致病性病毒病，其病原为II型鲤疱疹病毒(cyprinidherpesvirus2，CyHV-II)，上述病害频发给鲫鱼养殖业造成了破坏性影响。鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)属于有囊膜的含双链线性大DNA基因组病毒，核衣壳成六边形，直径为175～200nm[1-5]，CyHV-II感染鲫鱼可引起其内脏组织、鳃和体表广泛性出血，导致鲫的死亡率高达90％以上。CyHV-II常规检测技术中，LAMP技术反应原理复杂，引物设计繁琐，并且在引物设计时针对靶标序列所需要的保守区段较为严格，反应产物不均一，不利于后期的测序构建克隆，因此没有得到普遍应用；PCR技术耗时较长，成本较高，而且需要精密温度循环仪器，严重限制PCR技术在现场检测中的应用。近年来，恒温核酸扩增技术的出现解决PCR技术的局限性，且更加方便、迅速，是一种快速检测CyHV-II的可行性技术手段。重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepoly-meraseamplification，RPA)是恒温核酸扩增技术的一种，RPA利用T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32和BsuDNA聚合酶三种酶在37～42℃对目标片段进行等温扩增，可以在20～40min完成数十亿的DNA拷贝。RPA与荧光定量PCR技术(Real-TimePCR)相结合，RPA技术应用于诊断检测时，向反应体系中加入特异性的特定类型探针，可以达到实时荧光检测。进行检测时应用TwistAmpexo探针，此探针携带一个荧光基团和一个荧光淬灭剂，分别与一个胸腺嘧啶结合，中间由一个四氢呋喃(THF)碱基隔开，当此结构完整时，荧光强度低。探针的3'端予以封闭，阻断以此寡核苷酸序列充当引物进行扩增。当探针与靶序列结合时，连接荧光基团和淬灭基团的THF碱基位点就会被核酸内切酶识别并酶解，下游的淬灭基团被释放，荧光强度增强；酶切后产生的游3'-OH作为DNA聚合酶的靶点并扩增此探针，荧光强度也会随着其扩增而增强，检测时间也大大缩短。
技术实现思路
为克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针，基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepoly-meraseamplification，RPA)与实时定量PCR技术(Real-TimePCR)结合，实现II型鲤疱疹病毒(CyHV-II)的快速检测。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：用于恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA专用引物，是根据II型鲤疱疹病毒目的基因设计的，且所述II型鲤疱疹病毒目的基因序列为：cccaggagaccagcagactgttgaacccgtaccttgccaccaagggacagcgggtcgatccgtctaacttgtacattcccgacggtatctttgtgacttacacgcctactggaccagaccccggagtggcgcacggtggcggttactattacagaccttcgctgcagggtttcggctctatgatggacgaggcggatacgttggacgatctgcaggccaacgttctgtatagcaatcagggtcagtggacgagactggcgttgt。优选地，所述RPA专用引物的正向引物序列为CCCAGGAGACCAGCAGACTGTTGAACCCGTAC；所述RPA专用引物的反向引物序列为GTATCCGCCTCGTCCATCATAGAGCCGAAACC。本专利技术的第二方面，用于恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的探针，是根据II型鲤疱疹病毒目的基因设计的，且所述II型鲤疱疹病毒目的基因序列为：cccaggagaccagcagactgttgaacccgtaccttgccaccaagggacagcgggtcgatccgtctaacttgtacattcccgacggtatctttgtgacttacacgcctactggaccagaccccggagtggcgcacggtggcggttactattacagaccttcgctgcagggtttcggctctatgatggacgaggcggatacgttggacgatctgcaggccaacgttctgtatagcaatcagggtcagtggacgagactggcgttgt。优选地，所述探针序列为：cactctggcgacgcgtttgtggttgaaccgcca(BHQ1-dt)c(THF)g(FAM-dT)ggaggcttcaaaggc(C3spacer)。优选地，所述探针序列在第34个bp位置有一个(BHQ1-dt)基团，在第36bp位置有一个(THF)基团，在38bp位置有一个(FAM-dT)基团，尾部含有一个(C3spacer)修饰。需要进一步说明的是，根据RPA引物设计原则，RPA对引物长度的要求是30～35bp，扩增产物在500bp之内时，扩增效率较高；由于引物个别碱基差异会对扩增效果产生影响，为快速、灵敏检测II型鲤疱疹病毒，需要进行多次引物筛选。在本专利技术的优选实施例中，委托上海生物工程公司设计针对CyHV-II目的基因的特异性引物序列和探针序列，然后通过在保守基因区域设计一系列梯度候选引物，并根据RPA凝胶检测结果从中选择最佳引物。本专利技术的第三方面，恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒，包括上述RPA专用引物和上述探针。优选地，恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒，还包括含有ORF72质粒的阳性对照。优选地，恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒，还包括含有无菌ddH2O的阴性对照。与现有技术相比，本专利技术的积极进步效果在于：(1)本专利技术针对CyHV-II病毒设计的RPA专用引物和探针能够获得需要的CyHV-II目的基因，是运用RPA技术检测II型鲤疱疹病毒的关键，目前没有针对II型鲤疱疹病毒的RPA专用引物和探针，具有特异性。(2)本专利技术用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒可以快速且成功检测鲤疱疹病毒CyHV-II，37℃时最快反应10min即可判断检测样品阳性还是阴性。附图说明图1为实施例2RPA检测的特异性评价效果；图2为实施例3RPA检测的敏感性评价效果。具体实施方式下面结合附图给出本专利技术较佳实施例，以详细说明本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围不限于下述实施例。实施例1用于恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的的RPA专用引物和探针设计与筛选本实施例委托上海生物工程公司设计针对CyHV-II目的基因的特异性引物序列和探针序列，其中：正向引物序列为CCCAGGAGACCAGCAGACTGTTGAACCCGTAC；反向引物序列为GTATCCGCCTCGTCCATCATAGAGCCGAAACC。探针序列为：cactctggcgacgcgtttgtggttga本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA专用引物，是根据II型鲤疱疹病毒目的基因设计的，且所述II型鲤疱疹病毒目的基因序列为：cccaggagaccagcagactgttgaacccgtaccttgccaccaagggacagcgggtcgatccgtctaacttgtacattcccgacggtatctttgtgacttacacgcctactggaccagaccccggagtggcgcacggtggcggttactattacagaccttcgctgcagggtttcggctctatgatggacgaggcggatacgttggacgatctgcaggccaacgttctgtatagcaatcagggtcagtggacgagactggcgttgt。

【技术特征摘要】
1.用于恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA专用引物，是根据II型鲤疱疹病毒目的基因设计的，且所述II型鲤疱疹病毒目的基因序列为：cccaggagaccagcagactgttgaacccgtaccttgccaccaagggacagcgggtcgatccgtctaacttgtacattcccgacggtatctttgtgacttacacgcctactggaccagaccccggagtggcgcacggtggcggttactattacagaccttcgctgcagggtttcggctctatgatggacgaggcggatacgttggacgatctgcaggccaacgttctgtatagcaatcagggtcagtggacgagactggcgttgt。2.如权利要求1所述用于恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的RPA专用引物，其特征在于，所述RPA专用引物的正向引物序列为CCCAGGAGACCAGCAGACTGTTGAACCCGTAC；所述RPA专用引物的反向引物序列为GTATCCGCCTCGTCCATCATAGAGCCGAAACC。3.用于恒温实时检测II型鲤疱疹病毒的探针，是根据II型鲤疱疹病毒目的基因设计的，且所述II型鲤疱疹病毒目的基因序列为：cccaggagaccagcagactgttgaacccgtaccttgccaccaagggacagcgggtcgatccgtctaacttgtacattcccga...

【专利技术属性】
技术研发人员：王浩，吕利群，孙萌，许丹，姜有声，余琳，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31