肺癌miRNA检测的内参基因的鉴定制造技术

本发明专利技术公开了在肺癌病人中稳定表达的内参miRNA基因，包括hsa‑miR‑345‑5p或者hsa‑miR‑345‑5p和hsa‑miR‑99b构成的组合。该内参基因可以用于肺癌病人miRNA检测中目标基因的标准化，可以实现不同实验室间研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理。

【技术实现步骤摘要】
肺癌miRNA检测的内参基因的鉴定
本专利技术专利涉及到一种用于肺癌miRNA检测的内参miRNA基因的鉴定。
技术介绍
肺癌是全世界范围内肿瘤死亡的首要原因，在中国，肺癌的发病率逐年升高，死亡率也是位居肿瘤死亡首位。据世界卫生组织(WHO)估计，截至2025年，我国每年肺癌死亡病例将达到100万。近年来，尽管肺癌的诊断和临床治疗已取得很大进展，但患者的总生存时间仍很短，5年生存率不超过15％。目前的治疗手段对肺癌总生存率的提高效果不大，II-IV期肺癌患者5年生存率大约在40％-5％之间，而I期患者5年生存率可高达92％。已经证实，miRNA在组织和细胞中的表达表现为显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性。并且miRNA在外周血中的表达同样具有肿瘤相关性和组织特异性，同时与RNA比较，其表达稳定性更为显著。研究表明通过检测血浆或血清中的miRNA以诊断肺癌可能是可行的、稳定的及具有可重复性的研究方向。在基因表达研究中有各种因素可导致样品偏差，比如RNA的数量和质量，但是表达数据能通过内参基因的校正来修正这种偏差。miRNA内参基因的选择非常重要。有研究表明，内参基因的选择可对RT-PCR结果产生显著影响，若内参基因选择不恰当，将使样本间的基因表达差异被掩盖或者过度夸大，导致出现错误甚至与事实相反的结论。此外，由于miRNA的特异性表达与肿瘤类型密切相关，因此在选择内参基因时需考虑肿瘤类型、样本来源以及实验方法等因素，以针对性地选择合适的内参基因。近年来出现了用人工合成的非人类(如线虫)miRNA作为miRNA检测标准化的外源性对照，但是，外源性对照不能纠正样本采集的差异，所以并不是理想的选择。同时，一些内源性基因常被用作组织/细胞miRNA检测的内参基因，比如5SrRNA、18SrRNA和U6等，但是由于这些基因不是miRNA，不能代表miRNA的组分，而且这些基因的提取、反转录和PCR扩增的效率可能与miRNA有所不同。因此，这些基因也不是最理想的选择。目前尚无研究对肺癌研究中miRNA标准化的最佳参照基因进行系统性的鉴定和评估，因此，本领域迫切需要开发能够作为肺癌研究中microRNA标准化的参照基因，并建立检测miRNA，特别是循环miRNA的有效标准化方案。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术公开了一种肺癌miRNA检测的内参miRNA基因的鉴定。具体地，本专利技术提供一种miRNA在制备用于肺癌miRNA检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述miRNA为hsa-miR-345-5p。本专利技术还提供一种miRNA的组合在制备用于肺癌miRNA检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述组合为hsa-miR-345-5p和hsa-miR-99b构成的组合。其中hsa-miR-345-5p的序列为：5’-GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC-3’，hsa-miR-99b的序列为：5’-CACCCGUAGAACCGACCUUGCG-3’。本专利技术还提供用于肺癌miRNA检测的内参试剂在制备诊断肺癌的试剂盒中的应用。提供一种诊断肺癌的试剂盒，该试剂盒含有用于检测内参miRNAhsa-miR-345-5p或者hsa-miR-345-5p和hsa-miR-99b的组合的试剂。进一步地，所述试剂盒还包含用于miRNA提取及qRT-PCR反应所需的RNA分离液、试剂和酶，以及标准品或/和对照品。本专利技术还提供一种检测肺癌患者血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步骤：(1)提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为cDNA；(2)以步骤(1)获得的cDNA为模板，分别检测其中目的miRNA的编码序列的含量和hsa-miR-345-5p的编码序列的含量；(3)根据步骤(2)的结果，以所述hsa-miR-345-5p为内参基因，计算目的miRNA的相对表达量。进一步地，提供一种检测肺癌患者血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步骤：(1)提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为cDNA；(2)以步骤(1)获得的cDNA为模板，分别检测其中目的miRNA的编码序列的含量和hsa-miR-345-5p、hsa-miR-99b的编码序列的含量；(3)根据步骤(2)的结果，以所述hsa-miR-345-5p和hsa-miR-99b为内参基因，计算目的miRNA的相对表达量。本专利技术提供的血清/血浆miRNAs检测内参的优点在于：(1)血清/血浆miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA内参的成功研究有助于血清/血浆miRNAs在肺癌疾病早期诊断及预后判断等方面价值的临床转化，以及不同实验室之间研究结果的比较。(2)血清/血浆miRNAs内参检测试剂盒可用于检测不同受试者血清/血浆中的内参miRNAs，有助于反映不同受试者内参miRNA的基线表达水平，用于控制个体生物学差异导致的miRNA表达水平差异，以凸显真正与疾病相关的差异表达miRNA。(3)采用严密的筛选和验证方案，本专利技术人初期采用基因芯片对肺癌和正常人血清/血浆miRNAs进行表达量分析，以获取稳定表达的血清/血浆miRNAs，并应用qRT-PCR(探针法和染料法)的方法进行了单个样本验证；以上方法和策略的应用保证了血清/血浆miRNAs内参检测试剂盒的准确性。总之，hsa-miR-345-5p或者hsa-miR-345-5p和hsa-miR-99b的组合在肺癌患者中稳定表达，用hsa-miR-345-5p或者hsa-miR-345-5p和hsa-miR-99b的组合作为内参基因可以实现不同实验室间研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理，进而促进血清/血浆miRNA研究结果向临床成果转化，为临床医生提供更加精确的诊断、分型、预后判断以及个体化治疗的有力工具。以单个miRNA或两个miRNA的组合作为血清或血浆中的内参基因，适用于高、低通量的检测平台，对于大规模临床检测应用，降低了操作难度，简化了操作流程。具体实施方式实例1肺癌病人外周血中miRNA表达分析一材料和方法1、材料肺癌病人外周血均来自因肺癌住院病例，分别取30例肺癌病人和20例正常人外周血。2、方法2.1、外周血总RNA的提取按Triazol试剂盒说明书提取肺癌病人和正常人外周血细胞的总RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。步骤如下：(1)收集病人外周血，离心收集细胞，每管加入1mLTrizol试剂，混匀，室温放置5min。加入氯仿200μL，用力振荡15sec，室温孵育2～3min。(2)在4℃下以12000×g的速度离心15min，混合物分为红色的酚-氯仿相(下相)、白色的中间相以及无色的上层水相。总RNA分散在上层水相中。(3)将上层水相转移到一个新的Eppendorf管中，加入1mL无水乙醇，混匀以沉淀RNA。(4)室温孵育10min以上，在4℃下以12000×g的速度离心10min，可见白色的RNA沉淀贴于试管底壁。(5)弃上清，用70％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，在4℃下以7500×g的速度离心5min。(6)弃上清，空气中自然本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种miRNA在制备用于肺癌miRNA检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述miRNA为hsa‑miR‑345‑5p。

【技术特征摘要】
1.一种miRNA在制备用于肺癌miRNA检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述miRNA为hsa-miR-345-5p。2.一种miRNA的组合在制备用于肺癌miRNA检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述组合为hsa-miR-345-5p和hsa-miR-99b构成的组合。3.如权利要求1或2所述的应用，其中hsa-miR-345-5p的序列为：5’-GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC-3’，hsa-miR-99b的序列为：5’-CACCCGUAGAACCGACCUUGCG-3’。4.权利要求1或2所述的用于肺癌miRNA检测的内参试剂在制备诊断肺癌的试剂盒中的应用。5.一种诊断肺癌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有用于检测权利要求1或权利要求2所述的内参miRNA的试剂。6.根据权利要求5所述的诊断肺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含用于miRNA提取及qRT-PCR反应所需的RNA分...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱伟，
申请(专利权)人：朱伟，
类型：发明
国别省市：北京,11