一种生产氨基葡萄糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产氨基葡萄糖的方法。本发明专利技术提供了一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以N‑乙酰氨基葡萄糖为原料，在工程菌的作用下，生产氨基葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为N‑乙酰‑6‑磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶或几丁二糖脱乙酰酶。采用本发明专利技术提供的方法制备氨基葡萄糖，反应条件温和、工艺路线简单、产物纯度高、适合大规模的工业化生产，非常适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种生产氨基葡萄糖的方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种生产氨基葡萄糖的方法。
技术介绍
氨基葡萄糖，又叫葡萄糖胺(Glucosamine，GlcN)，简称氨糖，广泛存在于动物外骨骼及微生物细胞壁中。氨基葡萄糖广泛应用于食品、保健、化妆品、医药等行业。氨基葡萄糖是形成软骨组织细胞的重要营养素，是健康关节软骨组织的天然组成成分，可以帮助修复和维护软骨组织，并能刺激软骨组织细胞的生长与发育。目前，氨基葡萄糖的生产方法主要是甲壳素水解法。甲壳素水解法是酸解虾蟹壳中的甲壳素生产氨基葡萄糖，此方法造成了海洋资源的过渡捕捞，而且加工处理工艺产生的废液对环境污染较为严重，相关研究表明，利用该种方法得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏人群服用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生产氨基葡萄糖的方法。本专利技术提供了一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以N-乙酰氨基葡萄糖为原料，在工程菌的作用下，生产氨基葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶或几丁二糖脱乙酰酶。所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为EcDac蛋白；所述EcDac蛋白为如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为VcDac蛋白；所述VcDac蛋白为如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为TmDac蛋白；所述TmDac蛋白为如下(c1)或(c2)：(c1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c2)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。所述几丁二糖脱乙酰酶为TKDac蛋白；所述TKDac蛋白为如下(d1)或(d2)：(d1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d2)将序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。所述功能基因为EcDac基因；所述EcDac基因为如下(e1)或(e2)或(e3)的DNA分子：(e1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；(e2)在严格条件下与(e1)限定的DNA序列杂交且编码EcDac蛋白的DNA分子；(e3)与(e1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码EcDac蛋白的DNA分子。所述功能基因为VcDac基因；所述VcDac基因为如下(f1)或(f2)或(f3)的DNA分子：(f1)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；(f2)在严格条件下与(f1)限定的DNA序列杂交且编码VcDac蛋白的DNA分子；(f3)与(f1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码VcDac蛋白的DNA分子。所述功能基因为TmDac基因；所述TmDac基因为如下(g1)或(g2)或(g3)的DNA分子：(g1)编码区如序列表中序列5所示的DNA分子；(g2)在严格条件下与(g1)限定的DNA序列杂交且编码TmDac蛋白的DNA分子；(g3)与(g1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码TmDac蛋白的DNA分子。所述功能基因为TKDac基因；所述TKDac基因为如下(h1)或(h2)或(h3)的DNA分子：(h1)编码区如序列表中序列7所示的DNA分子；(h2)在严格条件下与(h1)限定的DNA序列杂交且编码TKDac蛋白的DNA分子；(h3)与(h1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码TKDac蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。所述功能基因通过重组质粒导入出发菌；所述重组质粒是将所述功能基因插入出发载体得到的。所述出发载体可为载体pBAD/HisB。所述重组质粒具体可为：在载体pBAD/HisB的多克隆位点(例如XhoI和EcoRI之间、NcoI和EcoRI之间或XhoI和SpeI之间)插入所述功能基因，得到的重组质粒。所述出发载体还可为pET系列质粒、pETduet系列质粒、pTXB1系列质粒、pTUB1系列质粒、pTYB1系列质粒等。所述出发菌可为大肠杆菌。所述出发菌可为大肠杆菌BW25113。所述出发菌还可为BL21系列菌株、Rosetta系列菌株、BW25113系列菌株、Origami系列菌株等。所述方法中采用液相反应体系；初始反应体系中，N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为50g/L。所述液相反应体系的溶剂为pH8.0的Tris-HCl缓冲液。所述液相反应体系由工程菌、N-乙酰氨基葡萄糖、TritonX-100和pH8.0的Tris-HCl缓冲液组成。初始体系OD600nm＝30。初始体系中，N-乙酰氨基葡萄糖浓度为50g/L、TritonX-100浓度为0.1％(体积百分含量)。所述方法中，反应条件为：25℃-42℃(优选30-37℃)、1-3h。所述方法中，反应条件为：37℃、1h。所述方法中，反应pH为7.0-8.0，优选为7.5-8.0。所述工程菌具体可先进行如下处理：(1)将工程菌培养至OD600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)；(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖进行诱导；(3)完成步骤(2)后，离心收集工程菌。所述工程菌具体可先进行如下处理：(1)将工程菌接种至液体培养基(例如LB液体培养基或2YT液体培养基或M9培养基)，振荡培养至OD600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)；(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100mL，振荡培养12小时；(3)完成步骤(2)后，离心收集工程菌。所述工程菌具体可先进行如下处理：(1)将工程菌接种至液体培养基(例如LB液体培养基或2YT液体培养基，液体培养基中还可含有抗生素，例如50μg/mL链霉素)，37℃、220rpm振荡培养至OD600nm＝0.6-0.8(具体可为0.7)；(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以N‑乙酰氨基葡萄糖为原料，在工程菌的作用下，生产氨基葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为N‑乙酰‑6‑磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶或几丁二糖脱乙酰酶。

【技术特征摘要】
1.一种生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：以N-乙酰氨基葡萄糖为原料，在工程菌的作用下，生产氨基葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶或几丁二糖脱乙酰酶。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为EcDac蛋白；所述EcDac蛋白为如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为VcDac蛋白；所述VcDac蛋白为如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶为TmDac蛋白；所述TmDac蛋白为如下(c1)或(c2...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡美荣，王雷，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11