【技术实现步骤摘要】
用于生产小干扰RNA的小干扰RNA表达系统及其应用序列表随专利申请电子提交的、具有816字节的大小和2016年11月15日创建日期的、名为“序列表”的序列表文件以引用的方式整体纳入本专利技术。
本专利技术涉及制备小干扰RNA(siRNA,小干扰核糖核酸)表达系统文库,以生产通过诱导靶基因RNA表达产物降解来沉默靶基因的siRNA的方法,所述靶基因RNA表达产物来自分离自细胞群,特别优选,但非排除地所述细胞群来自受试者,特别是患有疾病如癌症、感染性或遗传性疾病的人的细胞群的RNA。本专利技术进一步提供了特别优选,但非排除地通过使用发酵罐生产siRNA特别是从siRNA表达系统生产siRNA的方法。更进一步提供了通过使用产自siRNA表达系统的siRNA来识别用于治疗细胞群疾病的功能性靶基因和识别RNAi治疗剂的方法,以及使用识别的RNAi治疗剂治疗受试者的方法。更进一步提供了发酵罐和从细胞群分离的RNA整合生产siRNA表达系统文库,从所述文库生产siRNA,测定所述细胞群中靶基因沉默和生产一种或多种在所述RNAi筛选中识别siRNA种类的方法。
技术介绍
RNA干扰(RNAi)是存在于许多真核细胞中的进化上保守的生物过程。在RNAi过程中,短双链(ds)RNA分子,如siRNAs下调基因表达,即它们例如通过从基因表达的切割以诱导信使RNA(mRNA)的降解来发挥转录后基因沉默效果。通常,siRNA与RNA诱导的沉默复合物(RISC)相互作用,同时双链siRNA被切割,其中的引导链,即与反义链互补的一条链与RISC保持相连。与RISC结合的引导链随后通过碱基 ...
【技术保护点】
一种制备小干扰RNA(siRNA)表达系统文库以生产通过诱导靶基因RNA表达产物降解来沉默靶基因的siRNA的方法,所述方法包括:(i)从细胞群中分离一种或多种靶基因的RNA;(ii)从分离的RNA产生RNA片段;(iii)将RNA片段转化为dsDNA片段;(iv)将dsDNA片段克隆到载体中以形成克隆载体,每个载体包含一个或多个启动子和能够接受至少一个dsDNA片段插入的至少一个限制性酶位点,使得可以产生siRNA。
【技术特征摘要】
2016.11.15 US 15/351,7681.一种制备小干扰RNA(siRNA)表达系统文库以生产通过诱导靶基因RNA表达产物降解来沉默靶基因的siRNA的方法,所述方法包括:(i)从细胞群中分离一种或多种靶基因的RNA;(ii)从分离的RNA产生RNA片段;(iii)将RNA片段转化为dsDNA片段;(iv)将dsDNA片段克隆到载体中以形成克隆载体,每个载体包含一个或多个启动子和能够接受至少一个dsDNA片段插入的至少一个限制性酶位点,使得可以产生siRNA。2.权利要求1的方法,其中,所述RNA代表细胞群的转录组,以及其中细胞群来自人并包含癌细胞。3.权利要求1的方法,其中,步骤(ii)中产生的所述RNA片段具有约100个核苷酸至约700个核苷酸的长度。4.权利要求1的方法,其中,所述载体是进一步包含siRNA结合多肽表达框架的质粒,所述siRNA结合多肽表达框架包括启动子、编码siRNA结合多肽的序列和编码siRNA产生酶的序列,其中所述siRNA结合多肽是p19多肽而所述siRNA产生酶是大肠杆菌核糖核酸酶III。5.权利要求1的方法,其中,所述一个或多个启动子是T7启动子。6.权利要求1的方法,其中,产生的siRNA具有约19个碱基对至约22个碱基对之间的长度,以及其中siRNA表达系统文库包括表达系统群,每个表达系统能够表达在其整个长度上与不同靶基因RNA表达产物至少基本互补的siRNA。7.权利要求1的方法,其中,步骤(iv)包括:a)将DNA片段与衔接子连接,所述衔接子包含匹配所述载体中的至少一个限制性酶位点的至少一个限制性酶位点;b)以匹配所述衔接子的引物扩增所述dsDNA片段;c)通过能够识别所述衔接子上的限制性酶位点的限制性酶酶切所述dsDNA片段;d)将酶切的dsDNA连接到所述载体中。8.权利要求7的方法,其中,所述衔接子的限制性酶位点是SacI限制性酶位点,和所述衔接子包含SEQ.ID.NO:1和作为互补链的SEQ.ID.NO:2,以及步骤a)包括加入所述衔接子和连接酶。9.权利要求1的方法,进一步包括将克隆的载体转化入细菌细胞的步骤(v)。10.权利要求9的方法,其中,所述细菌细胞选自大肠杆菌细胞,和其中所述载体包含siRNA结合多肽表达框架,所述siRNA结合多肽表达框架包括启动子、编码siRNA结合多肽的序列和编码siRNA产生酶的序列,其中所述siRNA结合多肽是组氨酸标记的p19多肽而所述siRNA产生酶是大肠杆菌核糖核酸酶III,以及其中一个克隆的载体包含一个或多个dsDNA片段并被转化到一细菌细胞中。11.一种从siRNA表达系统产生siRNA的方法,包括:(i)提供细菌细胞形式的siRNA表达系统;(ii)使细菌细胞经受产生siRNA的条件;(iii)可选地分离所述siRNA。12.权利要求11的方法,其中,所述siRNA由权利要求9的siRNA表达系统产生,包括:(i)提供根据权利要求9的细菌细胞;(ii)使所述细菌细胞经受产生siR...
【专利技术属性】
技术研发人员:黄林峰,任雨田,张鸿智,G·考尔,
申请(专利权)人:香港城市大学,
类型:发明
国别省市:中国香港,81
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