一种鉴定食品中植物源性成分的特异性引物对及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性引物对，所述特异性引物对的上游引物序列如SEQ No.1所示，下游引物序列如SEQ No.2所示。本发明专利技术还提供一种通用引物在鉴定食品植物源性成分中的应用及其应用方法。所述方法包括提取待测食品总DNA，PCR扩增、克隆与测序、确定成分等步骤。利用本发明专利技术所述特异性引物对和PCR技术，能够快速、准确、灵敏地检测食品植物源性成分，并可在生产现场应用。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定食品中植物源性成分的特异性引物对及其应用
本专利技术属于遗传工程
，进一步属于食品成分分析
，具体涉及一种鉴定食品中植物源性成分的特异性引物对及其应用。
技术介绍
人类生存和生活离不开植物。植物通过光合作用为地球上的动物提供了生存所必需的氧气，并且植物是人类最主要的食物和能源来源，人类的食物绝大多数直接（粮食蔬菜水果）或间接（肉类）来自植物，占人类能源绝大比例的石油、煤炭、天然气也主要来自远古植物，很多植物还可以直接入药或从中提取有效成分制成药物，书籍报刊所用的纸张其原料也来自植物。此外，木材供我们建造居室、棉麻供我们制衣，树木花卉美化我们的环境，改善我们的气候。特别是“植物源性食品”在居民日常生活中占了重要地位。植物源性食品包括粮食（稻谷、小麦、大麦、玉米、黑麦、大豆除外）及其各种粮食加工制品（如面粉、淀粉等）、蔬菜及其制品（马铃薯、木薯除外）、油籽油料类（油菜籽除外）及其制品、中药材、干果和坚果与籽仁类（如核桃、各种瓜子等）、转基因食品、植物油（如花生油、大豆油等）、茶叶、可可咖啡原料类、麦芽、啤酒花、水果制品、调味料（指植物原料及粗加工品如胡椒、胡椒粉，大、小茴香及其粉面等调味料）、酱腌制品（指用盐、酱、糖等腌制的发酵或非发酵类植物源制品）、烟草制品类（烟叶除外）、辐照食品。然而，目前存在着大量的植物源食品生产不规范行为，这样就造成食品安全问题。这些食品安全问题主要包括在植物源性食品中掺假，如在橄榄油等较贵的食用油中掺加一些较为便宜的食用油，如玉米油、大豆油。在中草药中掺杂一些便宜的中草药或者用其它相似的植物代替昂贵中草药。粮食加工制品如较贵的植物淀粉做的粉条，其中可能掺杂其它便宜些的植物淀粉粉条。植物源食品还有一类问题就是商品成分标注不规范，其中可能在标注成分外添加其它未知成分，而乱添加一些过敏原类植物成分会对过敏体质人群造成极大的威胁。以上的一些例子可以对居民健康造成威胁同时也极大的损害了消费者的利益。目前，食品中植物源性成分的检验方式主要是感官检验和理化检验。这些传统鉴别方式主要凭借业内人士的经验积累，也存在着经验主义不能定性的缺点，缺乏一种高效的检测方法。随着科学技术的发展，分子生物学鉴定技术逐渐渗透到各个生物领域，但在食品植物源性成分检测领域的应用还很少。对一些保守基因，如：rbcl、psbA、psbD、matK等，的使用仅仅局限于植物分类鉴定，而没有相关研究将这些用于食品中植物源性成分的检测。为此，本专利技术研发了一种rbcl基因的特异性引物对及其在鉴定食品中植物源性成分中的应用。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种特异性引物对，所述引物对上游引物序列如SEQNo.1所示，下游引物序列如SEQNo.2所示。本专利技术的第二目的在于提供所述通用引物在鉴定食品中植物源性成分中的应用。本专利技术的第三目的在于提供应用所述特异性引物对鉴定食品中植物源性成分的方法，包括如下步骤：（1）提取待测食品总DNA；（2）PCR扩增：以总DNA为模板，使用所述特异性引物对进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物；（3）克隆与测序：将所述PCR产物插入重组载体，然后将所述重组载体转入大肠杆菌，扩繁后提取质粒，对质粒进行测序；（4）确定成分：将所述测序结果在NCBI上进行blast序列对比，确定所述食品中的植物源性成分。本专利技术的第四目的在于提供一种含有所述特异性引物对的试剂盒。附图说明图1为CTAB法提取的调料包与十多香总DNA；图中，M-分子量标记，TLB-调料包总DNA；SDX-十多香总DNA；图2为调料包与十多香总DNAPCR扩增产物；图中，M-分子量标记，TLB-调料包总DNAPCR扩增产物；SDX-十多香总DNAPCR扩增产物；图3为芝麻油总DNAPCR扩增产物；图中，M-分子量标记，1,2-芝麻油总DNAPCR扩增产物。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所做的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的一种特异性引物对的上游引物序列如SEQNo.1所示，下游引物序列如SEQNo.2所示。所述引物对可以应用于鉴定食品中植物源性成分，特别适用于调味料、干货、植物油等加工食品。本专利技术还提供了应用所述特异性引物对鉴定食品中植物源性成分的方法，包括如下步骤：（1）提取待测食品总DNA；（2）PCR扩增：以总DNA为模板，使用所述特异性引物对进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物；（3）克隆与测序：将所述PCR产物插入重组载体，然后将所述重组载体转入大肠杆菌，扩繁后提取质粒，对质粒进行测序；（4）确定成分：将所述测序结果在NCBI上进行Blast序列对比，确定所述食品中的植物源性成分。作为本专利技术的一种优选，所述PCR扩增体系为50μL体系：DNA模板1μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，5×buffer10μL，dNTP（10mmol/L）1μL,PhusionDNAPolymerase0.5μL，最后加ddH2O至50μL；PCR扩增反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s,30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。这里也可以使用EasyTaqPCRSuperMix等高保真酶作为DNA聚合酶。所述测序的方法为Sanger法测序或高通量测序。然后利用GenBank或BOLD等数据库进行blast分析。另外，可利用所述特异性引物对制成试剂盒，所述试剂盒可用于检测食品中植物源性成分。本专利技术在NCBI上搜索所有植物的保守序列，如rbcl，psbA，psbD及matK，采用生物信息学方法分析这些序列，挑选在所有物种中均保守的区域设计引物，该引物包含的基因区域要含有足够多的多态性以能够区分不同植物。本专利技术选择rbcl基因，所述rbcl基因的核心区段可以用于植物源食品组成成分的检测。通过设计合成引物，采用PCR技术检测植物源食品组成成分。该使用方法快速、准确、灵敏，可在生产现场应用。实施例1:检测“十多香”组成成分选取配方较为复杂的某品牌的十多香调味料，首先采用CTAB法提取该调味料的总DNA：称取0.2g十多香粉末，加入600µL的CTAB提取液（表1），研磨成匀浆；将匀浆液转入1.5mLEppendorf管，60℃～65℃水浴1h；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），颠倒混合；常温下，12000r/min离心15min；用枪小心将上清转移到新离心管中，注意不要吸动中间的蛋白质层；12000r/min,离心10min，将上清转移到新管中，仍旧要注意不要触动中间的蛋白质层；向上清中加入0.6倍至等体积异丙醇，彻底颠倒混匀，使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀；用玻璃棒或枪头挑出DNA沉淀，放到已经加入70％乙醇的1.5mLEppendorf管中，颠倒管子几次，以洗涤DNA，溶解其中含有的色素等物质；离心，倒出管中的酒精，并用枪将剩余的液体尽量吸净，真空浓缩仪干燥之后，向管中加入适量TE缓冲液溶解DNA。电泳检测提取的DNA（图1）。表1CTAB缓冲液配置方法以获得的DNA为模板,加入特异性引物，进行PCR扩增。PCR扩增体系为50μL体系：DNA模板1μL，上下游本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性引物对，其特征在于，所述引物对上游引物序列如SEQ No.1所示，下游引物序列如SEQ No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异性引物对，其特征在于，所述引物对上游引物序列如SEQNo.1所示，下游引物序列如SEQNo.2所示。2.一种权利要求1所述特异性引物对在鉴定食品中植物源性成分中的应用。3.根据权利要求2所述特异性引物对在鉴定食品中植物源性成分中的应用，其特征在于，所述食品包括调味料、干货、植物油。4.一种应用权利要求1所述特异性引物对鉴定食品中植物源性成分的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）提取待测食品总DNA；（2）PCR扩增：以总DNA为模板，使用所述特异性引物对进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物；（3）克隆与测序：将所述PCR产物插入重组载体，然后将所述重组载体转入大肠杆菌，扩繁后提取质粒，对质粒进行测序；（4）确定成分：将所述测序结果在NCBI上进行blast序列对比，确定所述食品中的植物...

【专利技术属性】
技术研发人员：白戈，谢贺，姚恒，杨大海，李永平，张谊寒，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53