裂性弧菌噬菌体ValDsh-1及包含该噬菌体的杀菌组合物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及裂性弧菌噬菌体ValDsh‑1及包含该噬菌体的杀菌组合物及其应用。该噬菌体可在短时间内快速抑制弧菌的生长，且抑制作用维持时间长。此外，该噬菌体的杀菌组合物安全、有效，且特异性强，生产成本低，在致病菌的控制过程中弥补了单一噬菌体疗法的不足。

【技术实现步骤摘要】
裂性弧菌噬菌体ValDsh-1及包含该噬菌体的杀菌组合物及其应用
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种裂性弧菌噬菌体ValDsh-1及包含该噬菌体的杀菌组合物及其应用。
技术介绍
我国是水产养殖大国。近年来，我国的水产养殖业获得迅猛发展。随着海水养殖规模的日益扩大和集约化养殖方式的不断推广，鱼类疾病的频繁发生对海水鱼类规模化养殖的健康发展造成了严重的威胁。鱼类的病原体主要包括细菌、病毒、寄生虫等，其中细菌性疾病是对鱼类危害程度较为严重的一类疾病。弧菌是能运动的芽孢短杆状细菌，广泛分布于近海岸、河口海区海水及生物体内，是海洋中最常见的细菌类群之一，同时也是引起海水养殖鱼虾细菌性疾病最重要的病原菌之一。弧菌的致病强度与宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素有关，属于条件性致病菌，其主要通过口或伤口感染，产生毒素，致使伤口肌肉溃烂化脓以及内脏器官的严重病变从而导致鱼虾类的死亡。由弧菌引起的疾病又称弧菌病，具有“流行面积广，发病率高，致死性强”等特点，是水产养殖动物的主要疾病，同时也被确定为是阻碍水产养殖业发展的重要限制性因素，给养殖业造成了巨大的危害。其中，以鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和杀鲑弧菌(Vibriosalmonicida)等弧菌引起的弧菌病被认为是鱼虾类养殖中最为严重的病害之一。目前，针对水产养殖相关动物疾病的预防和控制方法主要以化学抗生素法和免疫疫苗法，其中以化学抗生素使用为主。作为当前控制水产动物疾病的主要手段，化学抗生素法具有使用方便、见效快和疗效好等优点。但是，大批量频繁使用抗生素在控制病原菌的同时，极大了助长了病原菌的耐药性，并加速了广谱耐药菌的产生。这使得致病菌的耐药性问题日益严重。此外，化学药物残留也是导致人类食源性疾病产生的重要原因之一，对人类健康造成严重危害。噬菌体又称细菌性病毒，是一类专一性裂解细菌的病毒，在环境中分布广泛，种类多样，结构简单，具有很强的宿主特异性。最重要的一点，噬菌体裂解细菌的机制不受细菌耐药性的影响，其通过受体识别从而吸附在特定宿主菌表面，将自身遗传物质注入宿主体内进行自我复制组装，并最终通过裂解宿主菌释放子代从而实现自我的生长繁殖。利用噬菌体控制水产致病菌早在噬菌体被发现之前就有应用，但由于对噬菌体的研究不够充分，而抗生素在当时具有广谱抑菌效果，且疗效好见效快，这使得噬菌体应用被大大削弱。近年来，由于抗生素滥用引发的一系列耐药菌问题，使得噬菌体重新回归人们的视野，应用噬菌体控制致病菌的研究也在科学界引起了广泛兴趣。作为应对抗生素抗性的重要武器之一，噬菌体的临床应用潜力巨大，但就其当前单一噬菌体疗法的应用而言，其在应用过程中仍存在一些潜在的缺点，如裂解宿主谱窄，裂解能力持续时间短，宿主菌易产生抗性等，其中以宿主菌易产生抗性为单株噬菌体应用的主要缺陷。针对以上单一噬菌体疗法存在的不足，将多种噬菌体混合使用的鸡尾酒疗法应运而生。其通过多种噬菌体之间的复配既扩大了宿主谱范围，同时有效的抑制宿主菌抗性的产生，具有快速高效的裂解作用，目前在临床应用的研究中已取得较好的效果。此外，噬菌体鸡尾酒通过噬菌体之间的协同作用降低了在相等条件下单株噬菌体的添加剂量，起到了节约成本的作用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术针对由弧菌引起的水产养殖上鱼虾类疾病大肆传播的问题上，在抗生素过度使用引起弧菌耐药性菌株产生的基础上，从患病鱼虾病灶中分离致病性弧菌，并通过现场实验确定了该弧菌病原菌的致病性，以该致病性弧菌为宿主，从水环境中分离得到7株新的裂性弧菌噬菌体，通过形态观察，确定了该弧菌噬菌体的分类地位，并通过全基因组测序确定了该7株噬菌体的基因型。此外，通过平板点滴法，根据透明斑的有无，测定了弧菌噬菌体在32株不同种属菌株下的宿主谱。通过认识单一噬菌体对宿主菌的侵染特性，进一步评估了单株噬菌体在不同梯度感染复数(MOI)下的抑菌能力，进而根据各个噬菌体最病原性弧菌的裂解能力组合了2个噬菌体鸡尾酒组合，通过在单株噬菌体条件下确定的MOI从而进一步评估了该2个组合对病原性弧菌的生长抑制作用，由此我们了确定最佳的弧菌噬菌体鸡尾酒组合。我们该噬菌体在控制由弧菌引起的水产动物致病菌具有一定的潜力，应用空间广泛。本专利技术一方面涉及一种裂性弧菌噬菌体ValDsh-1，于2017年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2017549，分类命名为Vibriophage。该噬菌体均保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏时间为：2017年9月25日。经保藏中心于2017年10月10日检测为存活菌株。本专利技术所提供的裂性弧菌噬菌体ValDsh-1在治疗弧菌感染性疾病中具有很多优势，首先其可对耐药菌也具有很好的防治效果；其次，由于噬菌体的杀菌谱较窄，在复杂细菌的环境中——例如动物肠道——发生杀菌作用时，不会对益生菌造成伤害；第三，其效价较高，防治效果好。然而细菌能通过自然筛选或人工筛选对抗生素产生抗药性，同理，其也能对单一的噬菌体逐渐耐受。有鉴于此，本专利技术通过认识单一噬菌体对于侵染宿主的特性，评估单一噬菌体的感染能力，采用一定的混合方法构建噬菌体鸡尾酒，最后通过特定指标确定最佳的鸡尾酒组成，该噬菌体鸡尾酒既具有噬菌体的专一性特征，又弥补了单一噬菌体疗法易导致宿主菌抗性的不足，应用前景广泛。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及含有如上所述的裂性弧菌噬菌体ValDsh-1的杀菌组合物。在本专利技术的一些实施方式中，所述杀菌组合物含有所述裂性弧菌噬菌体ValDsh-1以及其它弧菌噬菌体中的至少一种；优选为裂性弧菌噬菌体。由于同种病毒(噬菌体)之间的感染途径、分子基础均具有很大的相似性，因此当同种噬菌体共同感染宿主时彼此间可能会促进感染效率，发挥协同作用。在本专利技术的一些实施方式中，所述杀菌组合物还包括裂性弧菌噬菌体ValLY-4，保藏号为：CCTCCNO:M2017553；裂性弧菌噬菌体ValSw4-1，保藏号为CCTCCNO:M2017552；裂性弧菌噬菌体VspSw-1，保藏号为CCTCCNO:M2017551；裂性弧菌噬菌体ValLY-2，保藏号为CCTCCNO:M2017554；裂性弧菌噬菌体ValLY-3，保藏号为CCTCCNO:M2017548；以及裂性弧菌噬菌体VpaJT-1，保藏号为CCTCCNO:M2017547中的一种或多种上述噬菌体均于2017年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名均为Vibriophage。本专利技术提供的噬菌体杀菌组合物可在短时间内快速抑制弧菌的生长，并抑制该病原菌噬菌体抗性的产生。此外，该噬菌体鸡尾酒安全、有效，且特异性强，生产成本低，在致病菌的控制过程中弥补了单一噬菌体疗法的不足。在本专利技术的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为弧菌噬菌体ValDsh-1，以及ValLY-4、ValSw4-1、VspSw-1、ValLY-2、ValLY-3、VpaJT-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
裂性弧菌噬菌体ValDsh‑1，于2017年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017549，分类命名为Vibrio phage。

【技术特征摘要】
1.裂性弧菌噬菌体ValDsh-1，于2017年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2017549，分类命名为Vibriophage。2.含有权利要求1所述的裂性弧菌噬菌体ValDsh-1的杀菌组合物；优选的，所述杀菌组合物含有所述裂性弧菌噬菌体ValDsh-1以及其它弧菌噬菌体中的至少一种。3.根据权利要求2所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物还包括裂性弧菌噬菌体ValLY-4，保藏号为：CCTCCNO:M2017553；裂性弧菌噬菌体ValSw4-1，保藏号为CCTCCNO:M2017552；裂性弧菌噬菌体VspSw-1，保藏号为CCTCCNO:M2017551；裂性弧菌噬菌体ValLY-2，保藏号为CCTCCNO:M2017554；裂性弧菌噬菌体ValLY-3，保藏号为CCTCCNO:M2017548；以及裂性弧菌噬菌体VpaJT-1，保藏号为CCTCCNO:M2017547中的一种或多种；上述噬菌体均于2017年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名均为Vibriophage。4.根据权利要求3所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物包括所述裂性弧菌噬菌体VpaJT-1、所述裂性弧菌噬菌体ValLY-3、所述裂性弧菌噬菌体VpaSw-1、所述裂性弧菌噬菌体ValSw4-1以及所述裂性弧菌噬菌体ValDsh-1。5.根据权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物中还包括各裂性弧菌噬菌体突变体中的一种或多种；优选的，所述突变体至少90％与对应的裂性弧菌噬菌体的天然序列相同。6.根据权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物中每种裂性弧菌噬菌体的含量≥106PFU/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：马迎飞，樊继强，王婧婷，陈玲，刘陈立，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44