一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法技术

本发明专利技术提供了一株高产1‑脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法，其保藏号为CCTCC NO.M2017849，命名为解淀粉芽孢杆菌HZ‑15，并进一步提供了解淀粉芽孢杆菌HZ‑15的构建方法及高产DNJ的方法。采用分子生物学技术，在之前实验室保存的产DNJ解淀粉芽孢杆菌LX‑12的基础上，通过同源重组方法成功构建了高产DNJ的工程菌HZ‑15。该菌株以黄豆为原料进行固体发酵，通过在固体发酵培养基中添加1%的麦芽浸粉和2%的乳糖，DNJ产量高达1117.2mg/kg。

【技术实现步骤摘要】
一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法
本专利技术属于微生物
，具体涉及一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法。
技术介绍
：随着糖尿病患者的日益增加，寻找治疗糖尿病的药物已成为医学领域的一大难题。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)简称DNJ，是一种哌啶类多羟基生物碱，其化学结构与葡萄糖类似，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，可以竞争性结合α-糖苷酶活性部位，当消化道中或糖蛋白加工过程中的糖苷酶被DNJ等多羟基生物碱竞争性抑制时，会出现糖类吸收障碍和糖蛋白寡糖链的合成异常等现象，从而具有抑制血糖升高、抗肿瘤、抗病毒等一些生物学活性。DNJ的来源很广泛，可通过植物、动物和微生物产生，因微生物具有生长繁殖快，易培养，且可通过菌种改良，发酵工艺优化的方法来提高产量等优点，近年来利用微生物合成DNJ已成为研究热点。已经发现的可以合成DNJ的微生物主要有芽孢杆菌和链霉菌。微生物中DNJ的合成途径相关研究表明，在芽孢杆菌中，葡萄糖通过异构化为果糖，之后经氨化、脱磷酸、氧化生成一种氨基糖，氨基糖经异构化生成甘露伊霉素(MJ)和野尻霉素(NJ)，最终还原生成了DNJ。转氨酶、肌醇磷酸酶和氧化还原酶分别由基因gabT1、yktC1和gutB1编码，是DNJ合成途径中的关键酶，这三个基因在解淀粉芽孢杆菌基因组上连在一起，形成调控DNJ合成的操纵子。然而在DNJ合成过程中，调控DNJ合成的关键酶不仅上述三种催化反应酶，还包括催化MJ转化为NJ的异构酶等，而尚未有研究者查找到相关的调控基因。目前通过菌株改造的方法来提高DNJ产量的研究相对较少。目前，已有野生菌发酵用于DNJ的生产，例如枯草芽孢杆菌B2利用豆渣进行发酵生产DNJ；解淀粉芽孢杆菌140N以可溶性淀粉为碳源发酵，其DNJ产量达到0.8g/L；但上述发酵的产量依然不理想，通过生物技术手段获得一株产量高的工程菌，一直是本领域技术人员努力的目标。
技术实现思路
：本专利技术提供一株可以高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌HZ-15，该菌株于2017年12月28日保存于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2017849。本专利技术的另一个目的在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌HZ-15高产1-脱氧野尻霉素的发酵方法，本专利技术提供的发酵方法包括固体发酵和液体发酵，两种发酵方式均可获得高浓度的目的产物。本专利技术的最后一个目的在于提供了解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15在制备DNJ中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一株可以高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15，所述的菌株通过下述方式构建得到：本专利技术通过同源重组的方法，在解淀粉芽孢杆菌LX-12(保藏编号为CCTCCNO.M2015234)的染色体上重组并整合了含有转氨酶基因gabT1，肌醇磷酸酶基因yktC1和氧化还原酶基因gutB1的表达盒，具体的，本专利技术所述转氨酶基因gabT1的表达盒依次含有P43启动子，转氨酶基因gabT1序列和amyL终止子；所述的肌醇磷酸酶基因yktC1的表达盒依次含有P43启动子，肌醇磷酸酶基因yktC1和amyL终止子；所述的氧化还原酶基因gutB1的表达盒依次含有P43启动子，氧化还原酶基因gutB1和amyL终止子。本专利技术所述转氨酶基因gabT1，肌醇磷酸酶基因yktC1和氧化还原酶基因gutB1所连接的P43启动子来源于枯草芽孢杆菌168的基因组，为强启动子，其可高效启动下游基因的表达。本专利技术所用的终止子为枯草芽孢杆菌168中淀粉酶基因amyL的终止子。本专利技术所述转氨酶基因，肌醇磷酸酶基因和氧化还原酶基因重组载体中的同源重组序列位于噬菌体位点。该位点为噬菌体蛋白的基因位点，位于整个基因组靠近5’端的位置，其特征在于：基因组上含有转氨酶基因gabT1，肌醇磷酸酶基因yktC1和氧化还原酶基因gutB1的表达盒，基因gabT1、yktC1和gutB1的表达盒位于解淀粉芽孢杆菌HZ-15基因组噬菌体位点的5′端第734285-740083位核苷酸序列，通过上述步骤构建筛选的阳性转化子进行发酵培养，最终通过高效液相色谱检测筛选出一株制备DNJ含量最高的菌株，即为本专利技术的DNJ高产菌株。至此，得到一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15，该菌株已于2017年12月28日保存于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2017849，分类命名：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HZ-15。解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15呈杆状，革兰氏阳性菌，产芽孢。培养初期在LB平板上菌落形态呈圆形突起、表面光滑、粘稠、挑之拉丝，随着培养时间的延长，菌落表面逐渐形成粗糙、皱褶的白色菌膜。常规生理生化实验表明，是好氧菌，接触酶，vp试验呈阳性，水解淀粉，还原硝酸盐成亚硝酸盐。解淀粉芽孢杆菌HZ-15产1-脱氧野尻霉素的固体发酵方法，其步骤包括：(1)固体发酵培养基的制备：将黄豆放入黄豆的3～6倍质量的水中在10～30℃下浸泡8～16h，倒掉多余的水，将其分装于培养容器中，厚度为两层黄豆厚，分别加入0.5～1.5％(w/w)麦芽浸粉和1.5～2.5％(w/w)乳糖，用封口膜封好，121℃，高压灭菌；(2)发酵条件为：种龄为9～11h，接种量(v/w)为7～12％，发酵培养温度为37～40℃，发酵时间为48～60h，黄豆装载量为50g/250mL三角瓶。解淀粉芽孢杆菌HZ-15产1-脱氧野尻霉素的液态发酵方法，其步骤包括：挑取HZ-15单菌落接到5mLLB培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜。将培养物以2％的接种量接到50mLLB培养基中，37℃，180r/min振荡培养9h，直至OD600到4.0，再以2％的接种量接种到30mL优化的液体发酵培养基中，180r/min，37℃培养48h。所述优化的液体发酵培养基配方为：麦芽浸粉70g/L，可溶性淀粉30g/L，K2HPO4·3H2O0.75g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O0.075g/L，pH为7.5；本专利技术的有益效果是：通过将DNJ合成途径中的关键基因(转氨酶基因gabT1、肌醇磷酸酶基因yktC1和氧化还原酶基因gutB1)整合到实验室之前保存的产DNJ解淀粉芽孢杆菌LX-12，再通过目的产物的筛选，构建了解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15；同时该菌株经固体发酵后，DNJ产量高达1117.2mg/kg。为以后的科学研究和大规模生产奠定了基础，具有广阔的应用前景。附图说明图1：基因gabT1、yktC1和gutB1重组载体中表达元件琼脂糖凝胶图；图1a：泳道M：DL5000分子量Maker；泳道1：启动子P43扩增产物；泳道2：终止子Amy扩增产物；泳道3：基因gabT1扩增产物；泳道4：基因yktC1扩增产物；泳道5：基因gutB1扩增产物，泳道6：基因gabT1上游同源臂gabT1-up扩增产物；泳道6：基因gabT1上游同源臂gabT1-down扩增产物；图1b：泳道M：DL5000分子量Maker；泳道1：基因yktC1上游同源臂yktC1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，所述的基因工程菌为：保藏编号为：CCTCC NO.M2017849。

【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，所述的基因工程菌为：保藏编号为：CCTCCNO.M2017849。2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌在制备1-脱氧野尻霉素中的应用。3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的固态发酵方法，包括下述步骤：（1）固体发酵培养基的制备：将黄豆放入黄豆的3~6倍质量的水中...

【专利技术属性】
技术研发人员：冀志霞，程相锦，陈守文，卢玉，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42