洛塞那肽及其类似物的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种洛塞那肽及其类似物的制备方法。该方法以氨基树脂为原料，先将树脂脱保护，再用逐一缩合的方式依次连接带有保护基的氨基酸，直至完成树脂肽合成。再通过裂解、纯化得到洛塞那肽及其类似物。本发明专利技术的制备方法工艺稳定、质量可靠、适合规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
洛塞那肽及其类似物的制备方法
本专利技术属于医药化学领域，具体涉及一种工业化大规模制备洛塞那肽的方法。
技术介绍
糖尿病是由多种病因引起的代谢紊乱疾病。根据国际糖尿病联盟(InternationalDiabetesFederation，IDF)统计，2012年全球糖尿病患者已超过3.71亿，死亡人数高达480万，估计到2030年全球将有近5.52亿患者。其中，Ⅱ型糖尿病患者占90％以上。聚乙二醇洛塞那肽是一种治疗Ⅱ型糖尿病的长效降糖药物，由江苏豪森药业公司开发。已有结果表明它可实现一周一次给药，减少了给药频率，提高了病人的顺应性，是一种新型的长效降糖药。聚乙二醇洛塞那肽以艾塞那肽作为阳性化合物，通过对天然存在的GLP-1模拟肽Ex-4(Exenatide)进行修饰改造，使其在体内能进一步抵抗DPP-IV的快速降解。同时注意到很多蛋白类及多肽类药物经聚乙二醇(PEG)修饰后能减轻药物的毒性及其抗原免疫性，延长药物在体内的半衰期及作用时间，提高其生物利用度，进而提高药物的治疗效果，在保证疗效的前提下，延长给药间隔，减少给药次数，提高病人的顺应性。聚乙二醇洛塞那肽在糖尿病经典模型动物上显示出良好的降血糖作用，具有明显的II型糖尿病治疗作用，且能避免低血糖及体重增加的不良反应；已有临床试验结果表明，本品降糖效果明显，药效持续时间长，同时无明显毒副作用。洛塞那肽是聚乙二醇洛塞那肽的关键中间体，是聚乙二醇洛塞那肽起到降糖作用的活性结构。洛塞那肽是一个由39个氨基酸组成的多肽，具有如下结构：His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Gln-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-NH2SEQNOID.1其中，D-Ala表示D型丙氨酸，-NH2为C端酰胺。目前，鲜有关于洛塞那肽制备方法的报道。仅在专利WO2006074600中，公开了使用多肽合成仪，小批量(0.25mmol)固相合成洛塞那肽的方法。该方法不适用于工业生产。因此，本领域迫切需要开发出一种工艺稳定、适合规模化生产的洛塞那肽的制备工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决上述问题，提供一种采用固相合成法制备洛塞那肽及其类似物的方法，可用于工业上大规模生产。本专利技术的技术方案是通过下列方式实现的：洛塞那肽及其类似物的制备方法：(1)、以氨基树脂为原料，加入脱保护剂，脱除氨基树脂的保护基,所述氨基树脂的保护基为Fmoc保护基；(2)、将上步所得脱除Fmoc保护基的树脂，采用逐一缩合的方式，按照肽序依次连接带有保护基的氨基酸，直至完成所有氨基酸缩合，缩合反应包括加入缩合剂，任选的，加入有机碱；(3)、加入脱保护剂至步骤2所得产物中，脱除氨基酸的Fmoc保护基，得到树脂肽；(4)、上述步骤3所得的洛塞那肽或其类似物树脂肽经裂解液处理，去除树脂和保护基，冲析沉降得到洛塞那肽或其类似物的粗品；(5)、粗品经纯化、冻干得精品。本专利技术中，所用到的脱保护剂为哌啶的DMF溶液，浓度5％～50％，优选15％～25％。根据本专利技术的制备工艺，步骤1中所用的氨基树脂为RinkAmide-AM树脂、RinkAmide-MBHA树脂或RinkAmide-PEGA树脂。根据本专利技术的制备工艺，步骤1氨基树脂载量为0.2～1.5mmol/g，优选0.5～1.0mmol/g。根据本专利技术的制备工艺，制备得到的洛塞那肽树脂肽结构：His(R)-D-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(trt)-Nle-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gln(trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys(trt)-氨基树脂，其中保护基R为Fmoc、Boc或Trt。其中Fmoc-His(Trt)-OH缩合反应中，以3-(二乙氧基邻酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮作为缩合试剂和以N,N-二异丙基乙胺作为有机碱，不需控制其它条件，可显著控制D-His1-洛塞那肽杂质。根据洛塞那肽的制备工艺，制备洛塞那肽所用的氨基酸分别以下列形式应用：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-His(R)-OH。其中保护基R为Fmoc、Boc或Trt。根据本专利技术的制备工艺，步骤2中所用的缩合剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、3-(二乙氧基邻酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)的一种或多种；或者选自N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)或3-(二乙氧基邻酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)的一种或多种。根据本专利技术的制备工艺，氨基酸与树脂的投料摩尔比为2：1～6:1。根据本专利技术的制备工艺，步骤(2)中缩合温度为10～30℃。根据本专利技术的制备工艺，步骤(2)中氨基酸缩合过程所用的有机碱选自N,N-二异丙基乙胺或三甲基吡啶。根据本专利技术的制备工艺，步骤(4)中裂解液为三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)或二硫苏糖醇(DTT)、三异丙基硅烷(TIS)和水组成的混合物。根据本专利技术的制备工艺，三氟乙酸(TFA)：1,2-乙二硫醇(EDT)：三异丙基硅烷(TIS)：水的质量比为85～94:2～5:2～5:2～5。根据本专利技术的制备工艺，三氟乙酸(TFA)：二硫苏糖醇(DTT)：三异丙基硅烷(TIS)：水的质量比为85～94:2～5:2～5:2～5。根据本专利技术的制备工艺，步骤(4)中裂解液与洛塞那肽树脂肽的体积重量比5～20：1，单位为ml/g，或者为8～15:1，单位为ml/g。根据本专利技术的制备工艺，步骤(4)中裂解反应时间为1～5小时，或者为2～4小时。另一方面，本专利技术提供了一种洛塞那肽及其类似物的纯化方法。根据本专利技术的制备工艺，步骤(5)中洛塞那肽粗品的纯化方法，使用高效液相反相纯化方法。纯化方法如下：a.制备柱填料：C18/C8类填料。b.纯化流动本文档来自技高网...

【技术保护点】
洛塞那肽及其类似物的制备方法，其特征在于：1)以氨基树脂为原料，加入脱保护剂，脱除氨基树脂的保护基；2)将上步所得的树脂，采用逐一缩合的方式，按照洛塞那肽或其类似物的肽序依次连接带有保护基的氨基酸，缩合反应包括加入缩合剂，任选的，加入有机碱；3)加入脱保护剂至步骤2所得产物中，脱除氨基酸的Fmoc保护基，得到洛塞那肽或其类似物的树脂肽；4)上述步骤3)所得的树脂肽经裂解液处理，去除树脂和保护基，得到相应肽的粗品；5)粗品经纯化、冻干得精品。

【技术特征摘要】
1.洛塞那肽及其类似物的制备方法，其特征在于：1)以氨基树脂为原料，加入脱保护剂，脱除氨基树脂的保护基；2)将上步所得的树脂，采用逐一缩合的方式，按照洛塞那肽或其类似物的肽序依次连接带有保护基的氨基酸，缩合反应包括加入缩合剂，任选的，加入有机碱；3)加入脱保护剂至步骤2所得产物中，脱除氨基酸的Fmoc保护基，得到洛塞那肽或其类似物的树脂肽；4)上述步骤3)所得的树脂肽经裂解液处理，去除树脂和保护基，得到相应肽的粗品；5)粗品经纯化、冻干得精品。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述洛塞那肽树脂肽结构为：His(R)-D-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(trt)-Nle-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Gln(trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys(trt)-氨基树脂，其中R为Fmoc、Boc或Trt。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述氨基树脂为RinkAmide-AM树脂、RinkAmide-MBHA树脂或RinkAmide-PEGA树脂。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述氨基树脂载量为0.2～1.5mmol/g，或者为0.5～1.0mmol/g。5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，氨基酸与树脂的投料摩尔比为2：1～6:1。6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)的缩合剂选自1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己...

【专利技术属性】
技术研发人员：周明，朱后田，袁恒立，王生斌，张丰盈，
申请(专利权)人：江苏豪森药业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32