一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法技术方案

本发明专利技术公开了一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法，属于生物医药领域。本发明专利技术将多个功能整合在一个生物相容性和安全性良好的载体中，具有pH刺激响应功能的核酸/药物装载的共聚物部分[接枝有聚(3‑叠氮基‑2‑羟丙基甲基丙烯酸酯)(PGMA‑N3)的聚甲基丙烯酸N,N‑二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)]组成，基于荧光的成像组分罗丹明B(RhB)，和半乳糖作为靶向配体。本发明专利技术提供的药物输送系统是安全的，能够发挥基因/药物治疗的协同作用，有望在临床应用上发挥巨大作用。

【技术实现步骤摘要】
一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法
本专利技术涉及一种肝靶向共输送基因/药物的整合纳米系统及制备方法，尤其是一种具有肝肿瘤组织靶向性、示踪性的可装载核酸类物质和药物的共聚物纳米胶束，属于生物医药领域。
技术介绍
数十年来肝癌一直是全球范围内第二大常见的癌症诱发死亡的主要原因，每年大约有75万例新发病例。并且，肝癌的发病率和死亡率呈逐年增加趋势，严重威胁着我国乃至全球人民健康和生命。肝癌发病率和死亡率的高发率主要归因于该疾病的晚期诊断和有限的可用治疗方法。另外，由于缺乏可用的移植供体，手术治疗不适合大多数患者。因此，开发新的肝癌治疗策略已迫在眉睫。纳米技术的蓬勃发展能够很好的改善目前肝癌治疗存在的弊端。由于纳米材料的物理化学性质可以通过调节其化学成分、尺寸、形状、结构、形态以及表面修饰等精确的改善，从而可以作为潜在的共同输送核酸类物质和药物的载体用于肝癌治疗。然而，目前的纳米载体因其会产生免疫原性，低转染效率和毒副作用等缺点阻碍了其临床应用的发展。此外，由于肝癌肝内和肝外转移复杂，目前用于肝癌治疗的纳米材料在皮下实体瘤小鼠模型研究体内治疗效果远远不够。阳离子聚合物聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)因其含有大量的氨基，近年来被大量用作负载带有负电荷的核酸形成稳定的复合物用于基因治疗。在酸性条件下可以触发海绵效应引起内含体逃逸，从而进行基因转染。此外，该聚合物可以通过自由基聚合技术很容易的与其他疏水片段形成共聚物，并通过亲水疏水相互作用将疏水药物包裹在这一疏水片段中。这些优点使PDMAEMA与其他聚合物结合成为实现用于肝癌治疗的核酸和抗癌药物共同输送的理想载体。对于肝靶向识别，由于肝细胞表面过量表达有去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)能够特异性识别配体从而减少毒副作用。半乳糖因其价格低廉、来源广泛及易于修饰等特点，已经被广泛用于修饰纳米材料应用于研究特异性靶向人体肝癌细胞在体外和体内(皮下实体瘤小鼠模型)抗肿瘤效应。另外，在纳米系统中引入荧光标记可以使得纳米材料在体内被实时监测，提高临床诊断和治疗的潜力。尽管为了获得能够实现核酸和抗癌药物的共同输送的纳米材料已经有很多相关研究，但是这些用于肝癌治疗的系统尚未被充分利用，将示踪分子和靶向分子引入到具有刺激性响应功能的核酸和抗癌药物共输送载体上也未见报道，将多种功能整合于同一种纳米载体用于肝癌靶向治疗仍是一种挑战。
技术实现思路
本项目针对将多种功能集中在同一纳米材料载体的难点问题，提出了一种新型整合治疗系统，通过设计一系列反应将多个功能性片段整合在一个生物相容性和安全性良好的载体中。首先，具有荧光成像功能的荧光分子(例如罗丹明B，RhB)经修饰成含溴的大分子引发剂，可以触发单体3-叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯(GMA-N3)和甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)发生自由基聚合反应，从而形成与荧光分子的共价相连聚合物，该聚合物中PGMA-N3通过亲疏水相互作用具备装载疏水性药物的功能，PDMAEMA部分因其含有大量的氨基可以包覆核酸类物质，并且在酸性条件下质子化，触发海绵效应引起内含体逃逸，从而进行基因转染并促进疏水药物药物释放。另一方面，具有肝靶向功能的半乳糖端基位经修饰含有炔基基团可通过与共聚物中PGMA-N3部分的叠氮基进行click反应共价键连在共聚物上，为载体提供稳定的靶向功能。该目标共聚物可以通过自组装形成集靶向、示踪、酸敏感与可同时装载药物和基因等多功能于一体的纳米胶束。本专利技术提供的纳米系统的生物相容性和细胞毒性已被认真评估，本专利技术所设计的整合纳米胶束还未见于报道。在体外研究了同时载有核酸和药物的共聚物纳米胶束的稳定性及酸性pH触发药物释放，在HepG2和Huh7细胞系中都研究药物输送，基因转染情况，以及基因/药物治疗的协同作用。此外，在皮下实体瘤和原位瘤小鼠模型中都进行了体内行为示踪和治疗功效评定。本专利技术首先提供一种用于治疗肝癌的酸敏感示踪聚合物纳米输送系统，可用于基因治疗与化疗联合靶向治疗肝脏疾病，所述输送系统为下面1式所示的化合物：上面的式1中，A为选自如下的一个或多个相同或不同的具有荧光示踪功能的荧光分子，例如罗丹明B、异硫氰酸荧光素、氟硼二吡咯等。B为选自如下的一个或多个相同或不同的具有半乳糖或半乳糖胺残基的单糖或寡糖类分子的靶向糖分子，其可以特异性识别肝癌细胞表面过度表达的去唾液酸糖蛋白受体；式1中包含甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)的单体结构，m表示其聚合度，m＝25；式1中包含3-叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯(GMA-N3)的单体结构，n表示其聚合度，n＝50；在本专利技术的一种实施方式中，荧光分子罗丹明B、DMAEMA与GMA-N3的摩尔比例为1:25:50，所述靶向糖分子与GMA-N3的比例为1:1。本专利技术还提供制备所述用于基因治疗与化疗联合靶向治疗肝癌的酸敏感示踪聚合物纳米输送系统的方法，是将示踪分子罗丹明B及靶向分子半乳糖分别通过引发剂修饰和click反应引入到共聚物中，包含以下步骤：步骤一、目标共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal的制备溴代罗丹明B引发剂，单体DMAEMA及单体GMA-N3按照摩尔比1:25:50加入到25mL圆底烧瓶中，用2mL四氢呋喃溶解，通30分钟氩气以除去瓶内氧气。其中单体DMAEMA需要预先出去其中的稳定剂，即将DMAEMA粗品快速通过碱性氧化铝柱。在氮气保护条件下，先后加入溴化亚铜和五甲基二亚乙基三胺，密封烧瓶，在氮气保护条件下室温反应8h。反应结束后，向反应液中加入四氢呋喃(10mL)，充分搅拌溶解瓶内反应液，通过中性氧化铝柱以除去混合溶液中的铜配体，收集所得液体旋转蒸发除去溶剂后，将瓶内粘稠液体逐滴缓慢滴加于石油醚(500mL)中，进行沉淀，反复沉淀三次，真空干燥所得沉淀物可得到罗丹明B修饰的共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-N3。将炔丙基修饰的脱乙酰半乳糖与罗丹明B修饰的共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-N3溶于5mLDMF中，然后再将硫酸铜与抗坏血酸钠溶于5mL水中，再滴加入上面的反应液中，反应液在室温下搅拌48h。将反应液过滤，水溶液中透析(透析袋截留分子量：8-10kDa)，即可得到目标共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal。步骤二、靶向治疗系统胶束Gal-micelles的制备1)步骤一所述的目标共聚物RhB-PDMAEMA25-c-PGMA50-Gal用DMSO溶解，搅拌5小时；2)在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得胶束溶液；3)将胶束溶液经冷冻干燥机冻干,制得胶束Gal-micelles。步骤三、载药靶向治疗系统胶束DOX@Gal-micelles的制备1)步骤一所述的目标共聚物和药物分别用DMSO溶解，将两种溶液混合搅拌5小时；2)混合溶液在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得载药胶束溶液；3)将聚合物胶束溶液经过0.45μm的微膜过滤除去未负载的药物，经冷冻干燥机冻干，制得负载药物的胶束DOX@Gal-micelles。步骤四、同时载质粒DNA(pGFP)/药物靶向治疗系统胶束DOX@Gal-micelles本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用于肝癌联合基因治疗与化疗的肝靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，是具有pH敏感性的单体甲基丙烯酸N,N‑二甲基氨基乙酯DMAEMA与疏水的单体3‑叠氮基‑2‑羟丙基甲基丙烯酸酯PGMA‑N3形成的共聚物，所述共聚物一端修饰有具有荧光示踪功能的罗丹明B，另一端修饰有肝靶向功能的半乳糖残基。

【技术特征摘要】
1.一种应用于肝癌联合基因治疗与化疗的肝靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，是具有pH敏感性的单体甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯DMAEMA与疏水的单体3-叠氮基-2-羟丙基甲基丙烯酸酯PGMA-N3形成的共聚物，所述共聚物一端修饰有具有荧光示踪功能的罗丹明B，另一端修饰有肝靶向功能的半乳糖残基。2.根据权利要求2所述的一种应用于肝癌联合基因治疗与化疗的肝靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，所述肝靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统用于共同装载用于基因治疗的核酸和用于化疗的药物。3.根据权利要求1或2所述的应用于肝癌联合治疗的靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，所述共聚物具有如式1所示的结构式：A为选自如下的一个或多个相同或不同的具有荧光示踪功能的荧光分子，例如罗丹明B、异硫氰酸荧光素、氟硼二吡咯等；B为选自如下的一个或多个相同或不同的具有半乳糖或半乳糖胺残基的单糖或寡糖类分子，其可以特异性识别肝癌细胞表面过度表达的去唾液酸糖蛋白受体。4.根据权利要求3所述的应用于肝癌联合治疗的靶向pH敏感性示踪共聚物纳米胶束系统，其特征在于，式1中包含DMAEMA的单体结构，m表示其聚合度，m＝25；式1中包含GMA-N3的单体结构，n表示其聚合度，n＝50；荧光分子为罗丹明B，罗丹明B、DMAEMA与GMA-N3的摩尔比例为1:25:50，所述靶向糖分子与GMA-N3的比例为1:1。5.根据权利要求2所述的应用于肝癌联合治疗的靶向pH敏感性示踪共聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹健，胡静，彼特·泽贝格，叶舟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32