本发明专利技术属于植物细胞培养技术领域。具体涉及以甘蓝型油菜下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的方法及其应用。本发明专利技术以甘蓝型油菜无菌下胚轴为外植体，通过胚性愈伤组织的诱导，悬浮细胞的培养等步骤建立了甘蓝型油菜悬浮细胞系，并利用该体系研究比较了必需微量营养元素正常和缺乏条件下悬浮细胞的形态和活性差异。本发明专利技术所制备的甘蓝型油菜悬浮细胞活性高，形态稳定均一，培养周期短，不受季节、气候等自然环境因素的限制，可用于甘蓝型油菜单细胞水平上细胞发育、以及在非生物胁迫下细胞生长、形态形貌、养分跨膜转运、生理生化代谢和基因表达等方面的研究与应用。
【技术实现步骤摘要】
以甘蓝型油菜下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的方法及其应用
本专利技术属于植物细胞培养
，具体涉及以甘蓝型油菜下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的方法及其应用。
技术介绍
甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)，十字花科，是世界上最重要的油料作物之一，在我国已成为继水稻、玉米、小麦、大豆之后的第五大作物，也是第一大油料作物，常年种植面积约670万hm2，广泛分布于我国长江流域，总产超过1100万t，年产菜籽油约450万t，占自产植物油总量的40％以上，占草本植物油总量的57％以上。传统上对甘蓝型油菜的研究都是基于植株，然而植株本身的复杂性导致研究进展缓慢，悬浮细胞作为单细胞避免了植株整体的复杂性。近年来，单细胞研究在其他物种上得到广泛应用，然而甘蓝型油菜仍缺乏一种高效，简便的单细胞培养技术。悬浮细胞作为一种单细胞得到了广泛关注，传统的甘蓝型油菜悬浮细胞培养体系获得的方法是利用小孢子培养得到的(OrrW.,KellerW.A.andSinghJ.1986,J.PlantPhysiol.126:23-32)，随后利用小孢子培养的方法取得的悬浮细胞系在一定程度上促进了甘蓝型油菜的研究(Carswell,M.C.,Grant,B.R.andPlaxton,W.C.,1997.Planta,203(1),pp.67-74；Moraes,T.F.andPlaxton,W.C.,2000.EuropeanJournalofBiochemistry,267(14),pp.4465-4476；Palma,D.A.,Blumwald,E.andPlaxton,W.C.,2000.FEBSletters,486(2),pp.155-158；Smith,C.R.,Knowles,V.L.andPlaxton,W.C.,2000.EuropeanJournalofBiochemistry,267(14),pp.4477-4485；Plaxton,W.C.,Smith,C.R.andKnowles,V.L.,2002.Archivesofbiochemistryandbiophysics,400(1),pp.54-62；Singh,V.K.,Wood,S.M.,Knowles,V.L.andPlaxton,W.C.,2003.Planta,218(2),pp.233-239.)，但是利用小孢子培养的方法获得的悬浮细胞系存在如下缺点：(1)易受取材季节制约，甘蓝型油菜每年开花一次，不能随时取样培养；(2)花粉在培养前要进行镜检以确定适宜的花粉发育时期，操作不方便，且易错过花粉发育的最好时期；(3)亲本植株的生理状态对愈伤组织诱导频率有直接影响，在气候环境不稳定的季节，油菜小孢子愈伤诱导率有明显差异。这些缺点严重制约了甘蓝型油菜单细胞水平的研究，因此，专利技术一种操作简便、不受季节和环境因子限制的获得甘蓝型油菜悬浮细胞系的方法是必要的。新兴的甘蓝型油菜悬浮细胞培养体系获得的方法着手于利用室内组培苗的方法，尝试利用甘蓝型油菜下胚轴为外植体获得的悬浮细胞系(王火焰等，2002年，植物营养与肥料学报。8(1)：100～104；杨玉华等，2002年，湖北农学院学报.22(4)：289-292；杨露，2012年，华中农业大学硕士毕业论文；Hua,Y等，2016，Plant,cell&environment,39(7),p.1601.)，克服了上述小孢子培养操作不方便及易受季节和环境因子限制的缺点，但是从公开的文章来看，该方法建立的细胞系细胞分散程度差，严重畸形，活力极低，难以为甘蓝型油菜的单细胞水平研究提供优异的生物材料。目前尚无成功利用甘蓝型油菜下胚轴为外植体培养愈伤组织获得悬浮细胞系的报道，因此必须在甘蓝型油菜中建立一种克服上述问题的悬浮细胞系，为甘蓝型油菜单细胞水平的研究提供新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用甘蓝型油菜下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的方法。本专利技术利用的甘蓝型油菜下胚轴可通过组织培养直接得到，通过愈伤组织诱导、继代和悬浮细胞培养的途径获得甘蓝型油菜悬浮细胞系。本专利技术的方法不受季节、气候等环境因素的影响，操作简便，细胞分散程度好，形态正常，活性较高，是一种高效的甘蓝型油菜悬浮细胞培养体系。本专利技术的技术方案如下所述：一种以甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的方法，包括以下步骤：(1)外植体的消毒：将清水浸泡过夜的甘蓝型油菜种子倒入三角瓶中，加75％的酒精灭菌30s，再用0.1％的氯化汞灭菌10min，用无菌水冲洗4～5次，将灭菌后的甘蓝型油菜种子播种于播种培养基上，所述的播种培养基以B5培养基为基础培养基，附加30g/L蔗糖和10g/L琼脂，补充蒸馏水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9，于24℃下暗培养5-7天，获得甘蓝型油菜无菌苗；(2)愈伤组织的诱导：将步骤(1)所得甘蓝型油菜无菌苗的下胚轴切成0.5～1cm茎段接种到愈伤组织诱导培养基上，于24℃下暗诱导得到甘蓝型油菜的愈伤组织；(3)愈伤组织的继代：将30日龄的甘蓝型油菜愈伤组织剔除褐化和老化的愈伤组织，转移至愈伤组织继代培养基上，于24℃下暗培养，继代培养1～2次，每次继代14-16天；(4)悬浮细胞系的建立：将颜色淡黄、质地疏松的胚性愈伤组织转移至悬浮细胞培养基上，每150mL的三角瓶装30mL悬浮细胞培养基，每瓶接种1g颜色淡黄和质地疏松的胚性愈伤组织，在25℃，转速为120r/min和暗培养的条件下培养，得到悬浮细胞系；其中：步骤(2)所述的愈伤组织诱导培养基的配制：以B5培养基为基础培养基，附加2.0mg/L的2,4-D，0.5mg/L的6-BA，30g/L的蔗糖，0.1g/L柠檬酸，300mg/L的水解酪蛋白，500mg/L的L-脯氨酸和8g/L琼脂，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9；步骤(3)所述的愈伤组织继代培养基的配制：以B5培养基为基础培养基，附加2.0mg/L的2,4-D，0.5mg/L的6-BA，30g/L的蔗糖，0.1g/L柠檬酸，300mg/L的水解酪蛋白，500mg/L的L-脯氨酸和8g/L琼脂，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9；步骤(4)所述的悬浮细胞培养基的配制：以改良的B5培养基为基础培养基，其成分为：二水氯化钙440mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/，氯化钾2940mg/L，碘化钾0.83mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，硼酸6.2mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，一水硫酸锰16.9mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/L，七水硫酸亚铁27.85mg/L，附加3mg/L的2,4-D，266mg/L的L-天冬氨酸，877mg/L的L-谷氨酰胺，228mg/L的L-精氨酸，75mg/L的甘氨酸，25g/L的蔗糖，0.1g/L的柠檬酸，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9。申请人提供了一种适用于以甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的的培本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体的消毒：将清水浸泡过夜的甘蓝型油菜种子倒入三角瓶中，加75％的酒精灭菌30s，再用0.1％的氯化汞灭菌10min，用无菌水冲洗4～5次，将灭菌后的甘蓝型油菜种子播种于播种培养基上，所述的播种培养基以B5培养基为基础培养基，附加30g/L蔗糖和10g/L琼脂，补充蒸馏水至1L，调培养基的pH至5.8‑5.9，于24℃下暗培养5‑7天，获得甘蓝型油菜无菌苗；(2)愈伤组织的诱导：将甘蓝型油菜无菌苗的下胚轴切成0.5～1cm茎段,接种到愈伤组织诱导培养基上，于24℃下暗诱导得到甘蓝型油菜的愈伤组织；(3)愈伤组织的继代：将30日龄的甘蓝型油菜愈伤组织剔除褐化和老化的愈伤组织，转移至愈伤组织继代培养基上，于24℃下暗培养，继代培养1～2次，每次继代14‑16天；(4)悬浮细胞系的建立：将颜色淡黄、质地疏松的胚性愈伤组织转移至悬浮细胞培养基上，每150mL的三角瓶装30mL悬浮细胞培养基，每瓶接种1g颜色淡黄和质地疏松的胚性愈伤组织，在25℃，转速为120r/min和暗培养的条件下培养，得到悬浮细胞系；其中：步骤(2)所述的愈伤组织诱导培养基的配制：以B5培养基为基础培养基，附加2.0mg/L的2,4‑D，0.5mg/L的6‑BA，30g/L的蔗糖，0.1g/L柠檬酸，300mg/L的水解酪蛋白，500mg/L的L‑脯氨酸和8g/L琼脂，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8‑5.9；步骤(3)所述的愈伤组织继代培养基的配制：以B5培养基为基础培养基，附加2.0mg/L的2,4‑D，0.5mg/L的6‑BA，30g/L的蔗糖，0.1g/L柠檬酸，300mg/L的水解酪蛋白，500mg/L的L‑脯氨酸和8g/L琼脂，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8‑5.9；步骤(4)所述的悬浮细胞培养基的配制：以改良的B5培养基为基础培养基：二水氯化钙440mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/，氯化钾2940mg/L，碘化钾0.83mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，硼酸6.2mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，一水硫酸锰16.9mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/L，七水硫酸亚铁27.85mg/L，附加3mg/L的2,4‑D，266mg/L的L‑天冬氨酸，877mg/L的L‑谷氨酰胺，228mg/L的L‑精氨酸，75mg/L的甘氨酸，25g/L的蔗糖，0.1g/L的柠檬酸，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8‑5.9。...
【技术特征摘要】
1.一种以甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)下胚轴为外植体获得悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体的消毒：将清水浸泡过夜的甘蓝型油菜种子倒入三角瓶中，加75％的酒精灭菌30s，再用0.1％的氯化汞灭菌10min，用无菌水冲洗4～5次，将灭菌后的甘蓝型油菜种子播种于播种培养基上，所述的播种培养基以B5培养基为基础培养基，附加30g/L蔗糖和10g/L琼脂，补充蒸馏水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9，于24℃下暗培养5-7天，获得甘蓝型油菜无菌苗；(2)愈伤组织的诱导：将甘蓝型油菜无菌苗的下胚轴切成0.5～1cm茎段,接种到愈伤组织诱导培养基上，于24℃下暗诱导得到甘蓝型油菜的愈伤组织；(3)愈伤组织的继代：将30日龄的甘蓝型油菜愈伤组织剔除褐化和老化的愈伤组织，转移至愈伤组织继代培养基上，于24℃下暗培养，继代培养1～2次，每次继代14-16天；(4)悬浮细胞系的建立：将颜色淡黄、质地疏松的胚性愈伤组织转移至悬浮细胞培养基上，每150mL的三角瓶装30mL悬浮细胞培养基，每瓶接种1g颜色淡黄和质地疏松的胚性愈伤组织，在25℃，转速为120r/min和暗培养的条件下培养，得到悬浮细胞系；其中：步骤(2)所述的愈伤组织诱导培养基的配制：以B5培养基为基础培养基，附加2.0mg/L的2,4-D，0.5mg/L的6-BA，30g/L的蔗糖，0.1g/L柠檬酸，300mg/L的水解酪蛋白，500mg/L的L-脯氨酸和8g/L琼脂，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9；步骤(3)所述的愈伤组织继代培养基的配制：以B5培养基为基础培养基，附加2.0mg/L的2,4-D，0.5mg/L的6-BA，30g/L的蔗糖，0.1g/L柠檬酸，300mg/L的水解酪蛋白，500mg/L的L-脯氨酸和8g/L琼脂，补充超纯水至1L，调培养基的pH至5.8-5.9；步骤(4)所述的悬浮细胞培养基的配制：以改良的B5培养基为基础培养基：二水氯化钙440mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/，氯化钾2940mg/L，碘化钾0.83mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，硼酸6.2mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，一水硫酸锰16.9mg...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐芳森，周婷，华营鹏，丁广大，石磊，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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