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一种降解酱油中生物胺的酶制造技术

技术编号:18015035 阅读:39 留言:0更新日期:2018-05-23 03:11
本发明专利技术公开了一种降解酱油中生物胺的酶,属于发酵技术领域。本发明专利技术提供的多铜氧化酶粗酶序列如SEQ ID NO.1所示,该酶对酱油中的色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺这几种生物胺具有,不同程度的降解作用,其中酱油中含量最多的酪胺浓度为540.71mg/L,添加本发明专利技术提供的多铜氧化酶粗酶后,24小时内就降低了100mg/L,与现有的纯酶添加进生物胺混合液24h,降低58.57mg/L相比,降解时间短,效果好。

【技术实现步骤摘要】
一种降解酱油中生物胺的酶
本专利技术涉及一种降解酱油中生物胺的酶,属于发酵

技术介绍
生物胺是生物体内产生的一类低分子质量含氮有机化合物的总称,它们是生物体合成荷尔蒙、核苷酸、蛋白质的前体。生物体自身合成的适量生物胺具有促进生长、增强代谢活力、加强肠道免疫系统、控制血压和消除自由基等生理功能,但是摄入过量外源生物胺会引起血管、动脉和微血管的扩大,导致生物体的不良反应,如高血压、头疼、腹部痉挛、腹泻和呕吐等。食品中常见的生物胺主要包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺和组胺等。根据检测市售31种酱油样品,酱油样品的总生物胺含量的范围为41.18-1898.17mg/L,其中组胺、酪胺是酱油样品中含量最高的生物胺,为0-490mg/L、0-650mg/L,其次为腐胺和苯乙胺,含量范围分别为0-595.98mg/L、0-334.96mg/L,FDA规定食品中生物胺总量≤1000mg/kg,而多数市售酱油总量为最高标准的1.5~2倍,组胺≤100mg/kg,而市售酱油为最高标准的4~5倍。酱油一般都是在非密闭环境中生产,杂菌控制十分困难,无法保证生产菌种的绝对单一性,因此,通过控制产氨基酸脱羧酶的微生物来控制生物胺的方法有限。目前,酶法降解生物胺最具可行性,不仅不损害食品营养,还不产生新的毒性物质,现有的生物胺降解酶有胺氧化酶,胺氧化酶包括伯胺氧化酶、二胺氧化酶、单胺氧化酶,其中伯胺氧化酶只能降解苯乙胺,最适pH7.0,二胺氧化酶只对二胺尤其是对组胺起作用,最适pH8.5,单胺氧化酶能降解酪胺、色胺,最适pH6.0~7.0,这几个酶存在3个共性问题:1)降解的生物胺类型少;2)降解效率低;3)最适pH偏中性,不适合应用于酸性发酵食品中,应用到酱油中的酶需要耐盐,耐酸。多铜氧化酶是一类可通过其光谱学性质,同源性的序列及与底物的反应机理定义的一类含铜氧化酶家族,它将生物胺催化氧化成对应的醛、氨和水,达到降低生物胺含量的目的。含多铜氧化酶基因的菌可代谢产生多铜氧化酶,将其所产生的多铜氧化酶进行粗提后加入酱油中,这将大幅度降低酱油中的生物胺,同时降低生产成本并提高食品安全性。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足,本专利技术创造性地采用酶法来降低生物胺,即筛选含有多铜氧化酶基因的菌株,将其所产生的多铜氧化酶进行粗提后加入酱油中,从而提供一种降解酱油中生物胺的酶及一种降低发酵食品中生物胺的方法。本专利技术的第一个目的是提供一种多铜氧化酶,其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供编码所述多铜氧化酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中,所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第三个目的是提供携带该基因的载体。本专利技术的第四个目的是提供表达该多铜氧化酶的重组菌。本专利技术的第五个目的是提供一种降低酱油中生物胺含量的方法,所述方法是向酱油中加入所述多铜氧化酶。在本专利技术的一种实施方式中,所述多铜氧化酶以酶液的形式存在。在本专利技术的一种实施方式中,所述多铜氧化酶以细胞为载体。在本专利技术的一种实施方式中,所述多铜氧化酶以10~20U/mL的添加量加入至酱油中。本专利技术还提供所述多铜氧化酶在食品、化工、医药领域的应用。有益效果:本专利技术提供的多铜氧化酶粗酶,对酱油中的色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺这几种生物胺具有不同程度的降解作用,其中酱油中含量最多的酪胺浓度为540.71mg/L,添加本专利技术提供的多铜氧化酶粗酶后,24小时内就降低了100mg/L,与现有的纯酶降解生物胺混合液(24h降低58.57mg/L)的技术相比,本专利技术具有在相同时间内降解效率高的优势。附图说明图1为降生物胺菌株的颜色筛选示意图;图2为Bacillusamyloliquefaciens中多铜氧化酶基因的PCR扩增结果;M,Marker;1,阴性对照;2,Bacillusamyloliquefaciens中多铜氧化酶;图3为多铜氧化酶在不同温度下的相对酶活;图4多铜氧化酶在不同pH下的相对酶活;图5金属离子对多铜氧化酶酶活的影响;图6盐浓度对多铜氧化酶酶活的影响;图7乙醇浓度对多铜氧化酶酶活的影响。具体实施方式实施例1含多铜氧化酶基因的菌株的高通量筛选1、不产生物胺菌株的高通量筛选将酱醪样品用无菌生理盐水混匀,稀释不同倍数涂布于LB培养基,37℃,静置过夜培养后,选择单菌落合适的平板。预先在每个孔板中加入1mLLB培养基,用Qpix420自动挑菌仪将单菌挑取至96孔板,37℃静止培养24h。再转接到生物胺检测液体培养基中(空白对照不接菌),37℃静置培养48h后观察颜色变化,和空白对照颜色一样不变色的为阳性,变紫色的为阴性。通过采用高通量筛选技术,从8000个菌株中筛选获得了70株阳性菌株。2、降生物胺菌株的筛选将70株阳性菌株接种到MRS培养基中,37℃静置培养24小时,离心收集菌体,用无菌生理盐水洗两遍,然后添加到生物胺混合液中,共培养48h,离心收集上清液,加入新制Cu(OH)2加热反应1min。含有多铜氧化酶基因的菌株,能够将生物胺催化氧化成对应的醛、氨和水,根据醛和新制Cu(OH)2反应生成砖红色的沉淀Cu2O这一现象,以反应液出现砖红色沉淀的为具有降解生物胺能力的阳性菌株,不变色的为阴性。如图1所示,试管1只含有生物胺混合液的空白对照;试管2为未出现砖红色沉淀的样品,和对照一样为蓝色;试管3为出现砖红色沉淀的样品。根据反应液呈现的砖红色沉淀的效果,筛选获得1株菌株,3、利用菌落PCR验证上述步骤筛选得到的菌株是否含有编码多铜氧化酶的基因跟据16SrDNA测序结果,鉴定所筛到的降生物胺菌株为Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌),根据NCBI中的BacillusamyloliquefaciensstrainCMW1(NCBIReferenceSequence:NZ_DF836084.1)中的多铜氧化酶的基因序列,设计引物,验证Bacillusamyloliquefaciens是否含有多铜氧化酶基因。引物:上游:ATGGCACTTGAAAAATTTGC下游:TTACTGCTTTTCTGTGACGTCPCR反应程序:95℃下先预变性3min,然后进行以下循环:95℃下变性30s,55℃下退火30s,72℃下延伸1min30s;34个循环后,72℃下延伸10min,4℃下保温。以Bacillusamyloliquefaciens的基因组为模板,PCR扩增,扩增结束后由1%琼脂糖凝胶电泳显示扩增结果,如图2所示,成功扩增获得1500bp左右的条带,与目的条带大小一致,经测序验证,Bacillusamyloliquefaciens中含有多铜氧化酶基因,其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。实施例2多铜氧化酶粗酶对酱油中生物胺的降解将所筛含多铜氧化酶基因的菌株,接种到含0.5~1mmol/LCu2+的LB培养基中,37℃,220rmp/min,培养18~24h,培养完成后,7000~10000r/min,离心5~10min收集菌体,重复2~3次,进行超声破碎。将得到的破碎液过滤离心,上清液经过3KD蛋白超滤管浓缩,得到浓缩3~5倍的粗酶液。取2ml粗酶液与2mL某品牌市售酱油进行混合,将混合物置于本文档来自技高网
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一种降解酱油中生物胺的酶

【技术保护点】
一种多铜氧化酶,其特征在于,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种多铜氧化酶,其特征在于,氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述多铜氧化酶的基因。3.根据权利要求2所述的基因,其特征在于,核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.携带权利要求3所述基因的载体。5.一种基因工程菌,其特征在于,表达权利要求1所述的多铜氧化酶。6.一种降低酱油中生物胺含量的方法,其特征在于,所述方法是向酱油...

【专利技术属性】
技术研发人员:方芳徐洁陈坚周景文曾伟主
申请(专利权)人:江南大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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